应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒

为了验证荧光免疫层析法检测 H7 亚型禽流感病毒的可行性,采用荧光免疫层析法分别对标准抗原和临床样品进行检测,评价该方法的特异性、敏感性、稳定性和方法的适用性。结果为 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出 H7N9、H7N2 亚型禽流感抗原阳性,对其他抗原检测结果为阴性;能检出 H7N9、H7N2 亚型禽流感病毒抗原(血凝效价 1:512)1 000 倍的稀释度;检测 10 次 H7N9 亚型禽流感抗原的变异系数为 1.12%,差异不显著;检测临床 100 份样品结果均为阴性。结果表明,应用荧光免疫层析法检测 H7 亚型禽流感病毒操作简便、试验时间短、不受人为因素干扰,适合市场、养殖场大规模的监测或检疫。

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的高度接触性传染病。AIV 属于正黏病毒科甲型流感病毒属,病毒基因组由 8 个单股负链 RNA 组成,共编码 12~13 种蛋白,根据表面蛋白 HA 和 NA,已知可分为 16 种 HA 亚型和 9 种 NA 亚型血清型 [1] 。根据 AIV 对鸡的致病性不同,可以将 AIV 分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒 (LPAIV)[2] 。目前,禽流感病毒 H5N1、H5N2、H5N6、H9N2、H7N7、H10N7 和 H10N8 等均有感染人的报道 [3] 。2013 年 3 年 31日首先在中国上海和安徽发现了 3 例人感染 H7N9 禽流感病例 [4] ,截止2017 年 3 月 8 日,根据世界卫生组织(WHO)、联合国粮农组织(FAO)和有关权威机构的报告,人感染 H7N9 亚型禽流感累计病例数达 1 292例 [5] 。由于 H7N9 亚型禽流感对人的高死亡率,对公共卫生安全和社会稳定造成较大的影响,对于该病防控,进行监测和早期诊断显得尤为重要。近几年来,荧光免疫层析技术在胶体金层析技术的基础上得到了较大的改进,已经广泛应用于动物疫病监测和诊断,为了验证荧光免疫层析法检测 H7 亚型禽流感病毒可行性,对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证,并对采集的临床样品进行了检测,现将结果报告如下。

1、材料与方法

1.1 临床样品

采自三鸟批发市场,共 100 份,其中鸡泄殖腔拭子 50 份,鸡喉拭子50 份,用 PBS 液 -20℃保存。

1.2 试剂和仪器

H7N9 亚型禽流感抗原、H7N2 亚型禽流感抗原、H5N1 亚型禽流感抗原、H9N2 亚型禽流感抗原、新城疫抗原均为哈尔滨维科生物技术开发公司产品,批号分别为:2014002、2014001、2015028、20150403、20150403;H5N2 亚型禽流感抗原由华南生物有限公司提供,批号:20140520;H6N6 亚型禽流感抗原为英国国家实验室产品,批号:06606-070306;H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条由深圳市易瑞生物技术有限公司提供,批号:20160104;荧光检测仪由深圳市易瑞生物技术有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 特异性试验方法

用 2mLPBS 液分别溶解 H7N9 亚型禽流感抗原、H7N2 亚型禽流感抗原、H5N1 亚型禽流感抗原、H5N2 亚型禽流感抗原、H6N6 亚型禽流感抗原、H9N2 亚型禽流感抗原、新城疫抗原,分别用 PBS 液 1:10 稀释,用移液器吸 75滋L加入 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上,15min 后,用荧光检测仪读取数值,结果判定以 cut off 值大于等于 80 判为阳性,小于 80判为阴性。

1.3.2 敏感性试验

分别用 PBS 液 10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍、100 000 倍、1 000 000 倍稀释 H7N9亚型禽流感抗原和 H7N2 亚型禽流感抗原,用移液器吸 75滋L 加入 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上,15min 后,用荧光检测仪读取数值,结果判定以 cut off 值大于等于 80 判为阳性,小于 80 判为阴性。

1.3.3 变异系数

用 PBS 液 1:1 000 稀释 H7N9 亚型禽流感抗原,用移液器吸 75滋L 加入 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上,15min 后,用荧光检测仪读取数值,结果判定以 cut off 值大于等于 80判为阳性,小于 80 判为阴性。

1.3.4 临床样品检测

用移液器吸 75滋L 临床样品加入 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上,15min 后,用荧光检测仪读取数值,结果判定以 cut off 值大于等于 80 判为阳性,小于 80 判为阴性。

2、结果

2.1 特异性试验结果

采用 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测不同毒株抗原,结果为 H7N9 亚型禽流感抗原、H7N2 亚型禽流感抗原阳性;H5N1 亚型禽流感抗原、H5N2 亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原、H9N2 亚型禽流感抗原、新城疫抗原均为阴性,详细结果见表 1。结果表明,H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出 H7N9、H7N2 亚型流感病毒,而对其他毒株检测结果均为阴性,H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条特异性强。

2.2 敏感性结果

H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能检测出到 1:1 000 倍稀释的 H7N9 亚型禽流感抗原阳性,1:10 000 倍稀释以后的检测结果为阴性;能检测到 1:1 000 倍稀释的 H7N2 亚型禽流感抗原检测结果为阳性,1:10 000 倍稀释以后检测结果为阴性,详细结果见表 2。结果表明,H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出 H7N9、H7N2 亚型禽流感抗原(血凝效价1:512)1 000 倍的稀释度。

2.3 变异系数检测结果

采用 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测 10 次 1:1 000 稀释的 H7N9 亚型禽流感抗原,结果均为阳性,详细结果见表 3,变异系数为 1.12%,差异不显著,结果表明 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测结果稳定。

2.4 临床样品的检测结果

采用 H7 亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测临床样品共 100 份,其中鸡泄殖腔拭子50 份,鸡喉拭子 50 份,结果均为阴性,详细结果见表 4。

3、讨论

H7N9 亚型禽流感是一种新型禽流感,传染源主要是带毒的家禽或家禽感染后通过粪便、唾液和鼻腔分泌物和粪便等排出的病毒,人主要是通过接触染毒家禽或者被其污染的物品或环境引起感染 [6] 。根据研究表明,活禽暴露是人感染 H7N9 流感的关键风险因素,活禽交易市场是传染源之所在,从对市场调查的结果来看,市场污染严重 [7] 。为了加强在源头上的控制,做好活禽交易市场的检疫,及时发现 H7N9 流感病毒, 建立 H7N9 流感病毒的快速检测方法显得尤为重要。传统的 H7N9 流感病毒检测方法,包括病毒分离鉴定、荧光 RT-PCR 方法、普通 RT-PCR 方法或者是 HA 和 NA 扩增后的测序。这些方法存在费时费力或对实验室生物安全等级要求高的缺点。荧光免疫层析法使用荧光微球标记,捕获被测样本中的 H7 亚型流感病毒。此次试验结果表明,应用该方法检测 H7亚型流感病毒特异性强,可以检测到 1 000 倍稀释的 H7N9 亚型禽流感抗原,稳定性好,适合大规模样品的检测。目前,我国流行的 H7 亚型流感主要为 H7N9 亚型流感,采用荧光免疫层析法检出 H7 亚型流感阳性的样品需再进一步进行荧光 RT-PCR 检测或病毒分离鉴定,确定H7 亚型流感的型别。

荧光免疫层析法是在胶体金免疫层析技术上进行的改进,改进后荧光免疫层析法与胶体金免疫层析技术相比更具优势,其示踪标记物采用更灵敏的荧光纳米微球,根据试验的结果显示荧光免疫层析法比胶体金灵敏度要提高100~1 000 倍 [8] ,并且荧光免疫层析法采用手持式荧光仪读取数值,受人为因素影响小,整个试验过程只需 20min。荧光免疫层析法操作简便,试验时间短,不受人为因素影响,适合活禽交易市场和养殖场 H7 亚禽流感病毒初筛,为防控H7N9 流感提供了一个新技术。

参考文献

[1] Y.M.Saif,H.J.Barnes,J.R.Glisson,et al. 禽病学(第 11 版)[M]. 北京: 中国农业出版社,2005:147-166.

[2]朱闻斐,高荣保,王大燕,等.H7 亚型禽流感病毒概述[J].病毒学报,2013,29(3):245-249.

[3] 黄珍霞,廖晓东. H7N9 亚型禽流感综合防控技术现状分析与对策研究[J].中国卫生事业管理,2013, (12):949-952.

[4]Gao R,Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J].N Engl J Med,2013,368(20):1888-1897.

[5]林丹,谢剑锋,严延生.H7N9 禽流感及相关疫情分析评估 [J]. 中国人兽共患病学报,2017,33(3):186-194.

[6]郑腾,张体银,白泉阳,等.H7N9 亚型禽流感病毒的研究现状及防控策略 [J]. 畜牧与兽医,2016,48(10):134-137.

[7] 蒋文明, 王艳,李金平,等.2014-2016 年华东地区某市活禽市场禽流感流行病学调查与分析[J].2017,34(1):14-18.

[8]何晖,王炳志,毕思远,等. 一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免 疫层析方法的建立[J].食品安全导刊,2016, (3):113-117.

作者:张险朋1,卢沛炯2,郑腾3*,万庆文2,黄炳炽1(1.广东省东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞523086;2.广东省东莞市万江农业技术服务中心,广东东莞523050;3.福建出入境检验检疫局/福建省检验检疫技术研究重点实验室,福州3500051)

福建省科技计划重点项目(项目编号:2014I0010)

作者简介: 第一作者: 张险朋(1979-),男,广东五华人,高级兽医师,从事动物疫病防控 和兽医实验室检测工作

* 通讯作者 郑腾(1969-),男,研究员,研究方向:动物及动物产品检疫。

责任编辑:董泽敏

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