高致病性禽流感和新城疫诊断技术有：血凝试验或血凝抑制试验、ELISA 试验和分子生物学检测（PCR）等。其中，血凝试验和血凝抑制试验操作简便、快捷、准确和实用，是基层兽医实验室常用的检测禽流感及新城疫抗体效价的试验方法。虽然 GB/T18936-2003和 GB/ T16550-2008 分别对高致病性禽流感和新城疫的诊断技术进行了详细的规定，但是本试验的细节需要完善，才会增加血凝试验和血凝抑制试验的判定准确性。笔者结合自身参加实验室能力验证的实践经验，将试验的注意事项按以下思路来进行详细的分析。简言之就是“思”“看”“做”三点。将此思路贯穿到此试验的前、中、后 3个时期中，对其需要注意的操作细节进行了解析。
一为“思”，思考操作要求，明白知识原理；二为“看”，观察操作细节，熟悉要素性质。三为“做”，进行标准操作，做到准确无误。
1、试验前准备工作
1.1 pH7.2 0.01mol/L PBS 的配制
“思”：在试验中用到的稀释剂为 PBS，也有的使用无菌生理盐水。比较起无菌生理盐水，PBS 不仅有盐平衡作用，还有调节适宜的 pH 缓冲作用。所以，试验优先使用 PBS 液。
调节 PBS 的 pH 值时，可以使用冰醋酸或者1mol/L 的NaOH。再用 pH 计对其 pH 值进行测定。
再者，PBS 一定要 121℃灭菌 15 分钟。
“看”：称量 PBS 时要准确。
使用容量瓶或者量筒时读数要以看准液体的凹液面为准。
“做”：使用容量瓶时先用少量水检验一下容量瓶是否漏水，以免引起定容不准确。1.2 阿氏液的配制。
“思”：阿氏液是一种红细胞保存液。同样可以用冰醋酸或者 1mol/L NaOH 调节 pH 至6.1, 121℃灭菌 15 min，2～8℃保存备用。
1.3 1%鸡红细胞悬液的配制
“思”：为了避免鸡只的红细胞的自凝现象，应采集 2～3只 SPF 公鸡或无禽流感和新城疫抗体的健康公鸡的血液与阿氏液等量混合。如果使用免疫公鸡替代，应增加洗涤次数和 时 间 。 用 pH 为 7.2 的0.01mol/L PBS 洗涤 3 次，每次以 2 000rpm 离心 5 min。洗涤后用 PBS 配制成 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，2～8℃保存备用。
用 PBS 配制鸡红细胞悬液，是因为 pH 为 7 时，红细胞沉淀最充分，图形最清晰。
“看”：当上清液清亮，下层红细胞泥表面层没有白色白细胞膜时，鸡红细胞才算是洗涤完全。若上层液体为呈红色时，说明悬液有溶血现象，则鸡红细胞悬液制作失败。
“做”：吸取白细胞和血小板层时，动作要轻，速度要慢，吸量要少，尽量避免血红细胞，然后吸走剩余的透明液体。
配制完 1%鸡红细胞悬液时，用胶头滴管吸取一管，透过阳光观察，可见管内流动红色絮状物为佳。
1.4 抗原溶解
“思”：抗原的保存温度为-20℃，反复冻融会降低抗原滴度，应避免反复冻融。
“做”：冻干的抗原和阳性血清按瓶签上规格标记的量，用 PBS 溶解。使用前要摇匀再添加。
1.5 10%～20%鸡红细胞泥的配制
“思”：鸭鹅鸽及哺乳动物的血清一般需进行非特异性凝集和抑制素的处理。如果不做预处理，容易发生非特异性反应。
“ 做 ”： 用 20%（10% ～20%）鸡红细胞泥（例如 1mL鸡红细胞 +4mL PBS）50μL，再加 50μL 待测血清，混匀。静置1 h 以上。吸取 25μL 上清液用于检测。其余步骤同鸡血，判别也一样
1.6 样品血清的处理
“思”[1,2] ：采集血样时不可随意左右摇晃，以免引起溶血。静放时不能在阳光下暴晒或放在较低的温度环境（0℃以下）中，易引起血样变质，冻结，导致血样失效；分离后的血清24 h 内试验的，冷藏保存，超过24 h，冷冻保存。但是血清不能反复冻融，这样会影响血清抗体效价。
气温在 23℃以上时，采集的活禽血样在 2 h 内可以析出清亮血清。气温在 10℃左右时，采集的活禽血样难以自然析出，应立即采集，针筒放入37℃培养箱中孵育 2 h，可见血清析出。
1.7 V 形微量反应板的选取
“思”：一般使用 90°V 形微量反应板。相对于 110°和130°板来讲，90°反应板具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清晰，结果容易判定等优点。
“看”：一般使用玻璃材料的 96 孔凝集板，V 形孔底需光滑明亮，对底部磨损严重的反应板要及时淘汰；
“做”：使用后立即用高压自来水把每个孔都冲洗干净，甩干。如果不清洁，洗净后可用棉签蘸酒精把孔底擦干净。再倒扣在 40℃恒温箱中烘干以备下次使用。
1.8 试验反应温度的调节
“思”：血凝试验和血凝抑制试验最佳反应温度为 20～25℃室温。温度较低时，红细胞沉淀的时间延长。室温高于25℃，相对湿度低于 50%时，水分蒸发，反应物溶解，红细胞自溶，不利于结果观察 [3] 。所以实验室要利用空调的冷气和暖气来调节试验的环境温度。
2、血凝（HA）试验
“思”：某些病毒有凝聚红细胞的能力。以此测定病毒的血凝效价。
“看”：加入 PBS、抗原，或者鸡红细胞悬液时，观察移液器的吸头是否套紧。使用排式移液器时，观察每个吸头吸取的液体是否均衡一致。使用过的和未使用过的吸头应分开放。加样时，一定要掌握各种成分准确的剂量。移液器吸头不要离开页面，以防止产生气泡，造成移液量不准。
同时观察吸入液体的黏稠性，像鸡红细胞悬液这种比较黏稠的液体，可以采用“慢吸快打”的方式，以避免出现气泡。
判定结果时，将反应板倾斜 60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（100%凝集）为最高稀释倍数的血凝效价。以红细胞对照完全沉淀的前后 5 min 内判定结果较好，在 30～40 min 左右。
“做”：孵育前要混匀。操作步骤可以参照国标进行。值得注意的是，每加入抗原或者鸡红细胞悬液后可轻摇反应板10 s，保证液体混合均匀，反应进行彻底。
为了保证鸡红细胞悬液浓度生物一致性，添加时一定要边添加边摇晃加液槽，确保沉底的红细胞均匀地溶解在悬液中。摇匀动作一定要轻，避免红细胞的破裂
3、4 倍抗原工作液的回滴试验 [4]
“思”：每次 HI 试验前，必须重新检测抗原的血凝效价，以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导致试验结果不准确。如果抗原浓度高，所测定的抗体效价水平偏低；如果抗原浓度过低，则所测定的效价偏高。
血凝试验中多孔抗原浓度，1 个 HAU 第 1 孔到第 11孔分别为：1∶2,1∶4，……1∶1024,1∶2048。举例来说明。若第 10 孔不流淌，则 1 个 HAU为 1:1024,4 倍 HAU 为 1:256。4HAU 配制工作液 25.6mL PBS加入 100μL 的抗原即可。配好的抗原必须在 4 h 以内使用完毕。
“做”：因为国标上未涉及此步骤，笔者将在此处进行详解。（1）在 A-B 行 1-6 孔加入25μL PBS； （2）AB 行第一空孔加入 4 倍抗原工作液 25μL；（3） 倍比稀释，最后一孔吸25μL 弃 去 ；（4） 每 孔 加 入25μL PBS；（5） 每 孔 加 入25μL 1%鸡红细胞悬液；（6）静置 30 min 观察结果。
“看”：结果判定，前 2 孔凝集，第 3 孔完全凝集抑制（流淌）为合格结果。
4、血凝抑制（HI）试验
“思”：有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象。血凝现象能被相应的抗体抑制，所以是一种测定抗体的技术。即加入特异性抗原后，使得原有的血凝反应受到抑制。
“看”：当阴性，阳性结果成立，结果才有有效性。倾斜反应板，观察红细胞有无泪滴状，完全不流淌的抗原最高倍数为HI 滴度。
设立血清对照、病毒对照和红细胞对照。记录好血清对照：红细胞沉于管底，无自凝；抗原对照孔，凝集；红细胞对照孔：无自凝。
参考文献
[1]仵国政，张培云.高致病性禽 流感和新城疫血凝及血凝抑制试验体会 [J]. 当代畜牧, 2016 （10）：96-97.
[2]马晓霞.如何控制禽流感血凝抑制试验的质量[J].畜牧兽 医科技信息,2013（06）：39.
[3]张智鹏.血凝和血凝抑制试验影响因素分析. 中国畜牧兽医[J],2013.37（10）：224-226.
[4]陆品红，王丽娟.4HAU 抗原 回滴操作在禽流感试验中的重要性[J].中国畜禽种业, 2009.5 （18）：134.
作者：阳一兰（深圳市龙岗区动物卫生监督所，广东深圳 518172）
责任编辑：曹伟胜
