血凝试验和血凝抑制试验的操作细节经验浅析

高致病性禽流感和新城疫诊断技术有:血凝试验或血凝抑制试验、ELISA 试验和分子生物学检测(PCR)等。其中,血凝试验和血凝抑制试验操作简便、快捷、准确和实用,是基层兽医实验室常用的检测禽流感及新城疫抗体效价的试验方法。虽然 GB/T18936-2003和 GB/ T16550-2008 分别对高致病性禽流感和新城疫的诊断技术进行了详细的规定,但是本试验的细节需要完善,才会增加血凝试验和血凝抑制试验的判定准确性。笔者结合自身参加实验室能力验证的实践经验,将试验的注意事项按以下思路来进行详细的分析。简言之就是“思”“看”“做”三点。将此思路贯穿到此试验的前、中、后 3个时期中,对其需要注意的操作细节进行了解析。

一为“思”,思考操作要求,明白知识原理;二为“看”,观察操作细节,熟悉要素性质。三为“做”,进行标准操作,做到准确无误。

1、试验前准备工作

1.1 pH7.2 0.01mol/L PBS 的配制

“思”:在试验中用到的稀释剂为 PBS,也有的使用无菌生理盐水。比较起无菌生理盐水,PBS 不仅有盐平衡作用,还有调节适宜的 pH 缓冲作用。所以,试验优先使用 PBS 液。

调节 PBS 的 pH 值时,可以使用冰醋酸或者1mol/L 的NaOH。再用 pH 计对其 pH 值进行测定。

再者,PBS 一定要 121℃灭菌 15 分钟。

“看”:称量 PBS 时要准确。

使用容量瓶或者量筒时读数要以看准液体的凹液面为准。

“做”:使用容量瓶时先用少量水检验一下容量瓶是否漏水,以免引起定容不准确。1.2 阿氏液的配制。

“思”:阿氏液是一种红细胞保存液。同样可以用冰醋酸或者 1mol/L NaOH 调节 pH 至6.1, 121℃灭菌 15 min,2~8℃保存备用。

1.3 1%鸡红细胞悬液的配制

“思”:为了避免鸡只的红细胞的自凝现象,应采集 2~3只 SPF 公鸡或无禽流感和新城疫抗体的健康公鸡的血液与阿氏液等量混合。如果使用免疫公鸡替代,应增加洗涤次数和 时 间 。 用 pH 为 7.2 的0.01mol/L PBS 洗涤 3 次,每次以 2 000rpm 离心 5 min。洗涤后用 PBS 配制成 1%(V/V)的鸡红细胞悬液,2~8℃保存备用。

用 PBS 配制鸡红细胞悬液,是因为 pH 为 7 时,红细胞沉淀最充分,图形最清晰。

“看”:当上清液清亮,下层红细胞泥表面层没有白色白细胞膜时,鸡红细胞才算是洗涤完全。若上层液体为呈红色时,说明悬液有溶血现象,则鸡红细胞悬液制作失败。

“做”:吸取白细胞和血小板层时,动作要轻,速度要慢,吸量要少,尽量避免血红细胞,然后吸走剩余的透明液体。

配制完 1%鸡红细胞悬液时,用胶头滴管吸取一管,透过阳光观察,可见管内流动红色絮状物为佳。

1.4 抗原溶解

“思”:抗原的保存温度为-20℃,反复冻融会降低抗原滴度,应避免反复冻融。

“做”:冻干的抗原和阳性血清按瓶签上规格标记的量,用 PBS 溶解。使用前要摇匀再添加。

1.5 10%~20%鸡红细胞泥的配制

“思”:鸭鹅鸽及哺乳动物的血清一般需进行非特异性凝集和抑制素的处理。如果不做预处理,容易发生非特异性反应。

“ 做 ”: 用 20%(10% ~20%)鸡红细胞泥(例如 1mL鸡红细胞 +4mL PBS)50μL,再加 50μL 待测血清,混匀。静置1 h 以上。吸取 25μL 上清液用于检测。其余步骤同鸡血,判别也一样

1.6 样品血清的处理

“思”[1,2] :采集血样时不可随意左右摇晃,以免引起溶血。静放时不能在阳光下暴晒或放在较低的温度环境(0℃以下)中,易引起血样变质,冻结,导致血样失效;分离后的血清24 h 内试验的,冷藏保存,超过24 h,冷冻保存。但是血清不能反复冻融,这样会影响血清抗体效价。

气温在 23℃以上时,采集的活禽血样在 2 h 内可以析出清亮血清。气温在 10℃左右时,采集的活禽血样难以自然析出,应立即采集,针筒放入37℃培养箱中孵育 2 h,可见血清析出。

1.7 V 形微量反应板的选取

“思”:一般使用 90°V 形微量反应板。相对于 110°和130°板来讲,90°反应板具有红细胞沉降速度快,产生的凝集图像清晰,结果容易判定等优点。

“看”:一般使用玻璃材料的 96 孔凝集板,V 形孔底需光滑明亮,对底部磨损严重的反应板要及时淘汰;

“做”:使用后立即用高压自来水把每个孔都冲洗干净,甩干。如果不清洁,洗净后可用棉签蘸酒精把孔底擦干净。再倒扣在 40℃恒温箱中烘干以备下次使用。

1.8 试验反应温度的调节

“思”:血凝试验和血凝抑制试验最佳反应温度为 20~25℃室温。温度较低时,红细胞沉淀的时间延长。室温高于25℃,相对湿度低于 50%时,水分蒸发,反应物溶解,红细胞自溶,不利于结果观察 [3] 。所以实验室要利用空调的冷气和暖气来调节试验的环境温度。

2、血凝(HA)试验

“思”:某些病毒有凝聚红细胞的能力。以此测定病毒的血凝效价。

“看”:加入 PBS、抗原,或者鸡红细胞悬液时,观察移液器的吸头是否套紧。使用排式移液器时,观察每个吸头吸取的液体是否均衡一致。使用过的和未使用过的吸头应分开放。加样时,一定要掌握各种成分准确的剂量。移液器吸头不要离开页面,以防止产生气泡,造成移液量不准。

同时观察吸入液体的黏稠性,像鸡红细胞悬液这种比较黏稠的液体,可以采用“慢吸快打”的方式,以避免出现气泡。

判定结果时,将反应板倾斜 60°,观察红细胞有无泪珠状流淌,完全无泪珠样流淌(100%凝集)为最高稀释倍数的血凝效价。以红细胞对照完全沉淀的前后 5 min 内判定结果较好,在 30~40 min 左右。

“做”:孵育前要混匀。操作步骤可以参照国标进行。值得注意的是,每加入抗原或者鸡红细胞悬液后可轻摇反应板10 s,保证液体混合均匀,反应进行彻底。

为了保证鸡红细胞悬液浓度生物一致性,添加时一定要边添加边摇晃加液槽,确保沉底的红细胞均匀地溶解在悬液中。摇匀动作一定要轻,避免红细胞的破裂

3、4 倍抗原工作液的回滴试验 [4]

“思”:每次 HI 试验前,必须重新检测抗原的血凝效价,以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确,从而导致试验结果不准确。如果抗原浓度高,所测定的抗体效价水平偏低;如果抗原浓度过低,则所测定的效价偏高。

血凝试验中多孔抗原浓度,1 个 HAU 第 1 孔到第 11孔分别为:1∶2,1∶4,……1∶1024,1∶2048。举例来说明。若第 10 孔不流淌,则 1 个 HAU为 1:1024,4 倍 HAU 为 1:256。4HAU 配制工作液 25.6mL PBS加入 100μL 的抗原即可。配好的抗原必须在 4 h 以内使用完毕。

“做”:因为国标上未涉及此步骤,笔者将在此处进行详解。(1)在 A-B 行 1-6 孔加入25μL PBS; (2)AB 行第一空孔加入 4 倍抗原工作液 25μL;(3) 倍比稀释,最后一孔吸25μL 弃 去 ;(4) 每 孔 加 入25μL PBS;(5) 每 孔 加 入25μL 1%鸡红细胞悬液;(6)静置 30 min 观察结果。

“看”:结果判定,前 2 孔凝集,第 3 孔完全凝集抑制(流淌)为合格结果。

4、血凝抑制(HI)试验

“思”:有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞,称为血凝现象。血凝现象能被相应的抗体抑制,所以是一种测定抗体的技术。即加入特异性抗原后,使得原有的血凝反应受到抑制。

“看”:当阴性,阳性结果成立,结果才有有效性。倾斜反应板,观察红细胞有无泪滴状,完全不流淌的抗原最高倍数为HI 滴度。

设立血清对照、病毒对照和红细胞对照。记录好血清对照:红细胞沉于管底,无自凝;抗原对照孔,凝集;红细胞对照孔:无自凝。

参考文献

[1]仵国政,张培云.高致病性禽 流感和新城疫血凝及血凝抑制试验体会 [J]. 当代畜牧, 2016 (10):96-97.

[2]马晓霞.如何控制禽流感血凝抑制试验的质量[J].畜牧兽 医科技信息,2013(06):39.

[3]张智鹏.血凝和血凝抑制试验影响因素分析. 中国畜牧兽医[J],2013.37(10):224-226.

[4]陆品红,王丽娟.4HAU 抗原 回滴操作在禽流感试验中的重要性[J].中国畜禽种业, 2009.5 (18):134.

作者:阳一兰(深圳市龙岗区动物卫生监督所,广东深圳 518172)

责任编辑:曹伟胜

人已赞赏
经验交流

科学高效合理使用兽药保障养殖和消费者健康安全

2019-10-12 16:20:52

经验交流

广西三黄鸡选育及产业化

2019-10-12 21:44:46

0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索