禽偏肺病毒病原学特性及分子生物学检测方法研究进展

禽偏肺病毒可感染火鸡、鸡、雉鸡、珍珠鸡和鸵鸟等多种禽类,引起禽偏肺病毒病,该病在世界范围广泛流行,传染性强,传播迅速,容易继发多种疾病,给养禽业造成严重经济损失。分子生物学检测法是当前确诊禽偏肺病毒病现症感染最有效的方法,本文就禽偏肺病毒 5 种分子生物学检测方法进行综述,对禽偏肺病毒病的诊断和防控有一定的参考价值。

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)属于副黏病毒科、偏肺病毒属 [1] ,感染火鸡、鸡、雉鸡、珍珠鸡和鸵鸟等多种禽类,引起禽类呼吸道症状、头部肿胀和产蛋率下降等。火鸡鼻气管炎、禽鼻气管炎和鸡肿头综合征等多种疾病都因 aMPV 感染而发生,这类疾病也成为禽偏肺病毒病。主要通过水平方式传播,尚未有垂直传播的证据。各日龄禽类均可感染,4~7周龄发病率高。该病传染性强,传播迅速,病程可持续 2~3 周,单独感染时仅出现一过性轻微呼吸道症状,死亡率不超过 5%,当继发其他疾病时,死亡率可达 40% [2] ,给养禽业造成严重经济损失 [3] 。1978 年,南非共和国首次报道了aMPV 引起的火鸡鼻气管炎,并于 1989 年成功分离到病毒,随后英国、美国、以色列、法国和日本等国均有报道。1998 年我国学者沈瑞忠首次从肿头综合征肉鸡中分离了 aMPV [4] ,目前已证实 aMPV 在我国鸡群感染率高 [5] 。本文就近年来 aMPV 的分子核酸探针法、常规 RT-PCR 法、套式 RT-PCR 法、荧光 RT-PCR方法、环介导等温扩增技术等 5 种生物学检测方法研究进展进行综述,以期为禽偏肺病的快速诊断和防控提供参考。

1、病原学特性

aMPV 病毒粒子可呈椭圆形、圆形等多种形状 [7] ,直径大小 80~200 nm,有囊膜。表面有纤突,长 13~14 nm,不能凝集红细胞。对乙醚敏感,不耐热,56 ℃ 30 min 可灭活,pH 值 3~9 时病毒可保持稳定,当存在有机物时,病毒外界抵抗力强,20 ℃条件下,家禽垫料中病毒可存活4周,37 ℃时可存活长达 2 周。常用的消毒剂如过氧乙酸、2%的氢氧化钠溶液、戊二醛及 2%的甲醛溶液均能有效杀灭病毒。根据抗原性和基因特异性,aMPV 分为 A、B、C 及 D 4 种型 [6] ,其中 A、B在世界范围广泛流行,C、D在局部地区流行,我国主要流行 A、B和 C 3种血清型。aMPV 核酸为不分节段、单股负链RNA,基因组长度约为 14 kb,共编码 8 种结构蛋白,从 3′端到 5′端依次为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、第二基质蛋白(M2)、小疏水蛋白(SH)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)。

2、分子生物学检测方法

2.1 核酸探针法

核酸探针是利用核苷酸碱基顺序互补的原理,用特异的基因探针与被测定的靶序列互补,以检测被测靶序列的技术,可定性或定量检测特异 RNA 或 DNA 序列,它具有操作简单,结果易于判定等优点,适合在基层推广使用。陈琳等 [8] 根据 GenBank 中已经发表的 B 亚型 aMPVF 基因的保守序列设计并合成 1 对引物,利用RT-PCR 扩增出 1 条与目的片段大小一致的725 bp 基因片段,回收、纯化 PCR 产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的 aMPV 核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与 aMPV 核酸发生特异性杂交,而与 H9N2 亚型 AIV、NDV、IBV、ORT 和 E.coil 的核酸杂交反应均为阴性,敏感性检测结果表明,该探针对 aMPV 的最低检出量为 5 pg。

2.2 常规 RT-PCR 法

RT-PCR 是以病毒的 RNA 为模板进行反转录,再以PCR 进行核酸扩增来检测病毒的方法,较病毒分离鉴定等传统的方法,检测速度快,灵敏度高,在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。陈琳等 [9] 根据 GenBank 中已经发表的 B亚型aMPV F 基因的保守序列设计并合成 1 对引物,利用 RT-PCR 可以扩增出 1 条 725 bp 的片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了aMPV 病的 RT-PCR 检测方法。特异性试验表明,建立的 RT-PCR 检测方法能够从 aMPV 疫苗毒株 VIR 115-B 中扩增到 725 bp 的特异性片段,而对 H9N2 亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的扩增结果均为阴性,敏感性试验表明,该方法最低检出量的 cDNA质量浓度为 1.45 μg/L,对山东省 492 份病料进行检测,阳性检出率为 43.09%(212/492),随机挑取 11 份进行克隆测序及序列分析,结果显示所扩增到的阳性产物均为 B 亚型的 aMPV。

2.3 套式 RT-PCR 法

套式 RT-PCR,又称巢式 RT-PCR。采用 2对引物扩增目的基因片段,第 2 对引物在第1对引物的内部设计,以第 1 对引物的扩增产物为模板进行再次扩增,经两轮扩增,保证扩增产物的特异性,提高了 PCR检测的敏感性。薛聪等 [10] 根据Gen Bank 发布的 B 亚型 aMPVF 基因的保守序列设计 2 对引物,建立了一种适用于 B 亚型aMPV 的逆转录套式 PCR 检测方法。此方法具有高度特异性和敏感性,以 H9 亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性。经检测,该方法第 1 次 PCR 扩增的敏感性为 107 拷贝/μL,第 2 次扩增的敏感性为 102 拷贝 /μL,第2 次扩增敏感性比第 1 次高 105 倍。

2.4 荧光 RT-PCR 方法

荧光 RT-PCR 是在常规 RT-PCR 技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,它融汇了传统 PCR 技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,检测速度快、敏感性高,可直接观察扩增结果,不需要后续电泳检测扩增产物,减少了对环境气溶胶污染的可能,避免了假阳性结果。依信号基团的不同,实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法 2 种。王丽荣等 [11] 根据 Gen-Bank 登录的 B 亚型 aMPV F 基因序列设计 1 对特异性引物,建立 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性 关系,产物 T 值 在83.0~83.7 ℃之间,灵敏度为 7.9×102 拷贝/μL,特异性和重复性较好。刘佳佳等 [12] 根据Gen Bank 中 C 型 a MPV P 基因序列,设计出一对特异性引物和 Taqman 探针,建立了 C 型aMPV Taqman 探针荧光定量 PCR 方法。结果表明,该方法只对 C 型 aMPV 检测为阳性,具有良好的特异性,能够检测到(3.63×102 )拷贝数,具有良好的敏感性,建立的标准曲线斜率为-3.312,截距为 44.66,相关系数为 R2=0.999,循环阈值和模板拷贝数具有良好的相关性,组内及组间重复性好。陈基明等 [13] 根据 GenBank 发表的 aMPV F 基因序列,设计 1 对特异性引物,建立 C 亚型 aMPV 的 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和攻毒样品的检测。结果显示:标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,建立的方法只能检测出 C 亚型 aMPV,最低可以检测到0.8×101 拷贝 /μL 的核酸模板,重复性试验的变异系数小于 4%。应用建立的方法对 43 份临床样品检测,结果显示均为阴性,对 42 份 35 日龄 SPF 鸡人工感染后 1~21 天的气管和肺脏样品进行检测,结果显示攻毒样品均为阳性。

2.5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增 (LAMP) 方法是日本学者Notomi 等发明的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术,不需要复杂的仪器设备,一台水浴锅或恒温箱就能实现反应,结果可通过肉眼观察白色混浊或绿色荧光的生成来判断,简便快捷,具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点,特别适合在现场和基层部门应用。鞠小军等 [14] 针对 B 亚型 aMPV F 基因的特异性引物,并从反应时间、温度、各组分浓度等方面优化了反应体系和反应条件,建立了 B 亚型 aMPV 逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。该方法能够在 63℃条件下 1h 内实现 B 亚型 aMPV F基因片段的特异性扩增,与其他病毒,如 H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊病病毒等的核酸无交叉反应。反应结果可直接用肉眼判断。对质粒 DNA的最小检测量为 1×102 拷贝 /μL。

3、小结

疾病的正确诊断是进行有效防控的前提和基础,随着规模化养殖的发展,临床上的禽病变得越来越复杂,老病新发和疾病混感现象增加,很难通过临床表现和眼观病变诊断疾病,需要通过实验进行精准诊断,从而及时采取有效的措施,降低损失。aMPV 病虽然在火鸡上存在几十年了,也是对火鸡危害最严重的几种疾病之一,但在鸡上的研究并不多,主要引起鸡肿头综合征和减蛋,近年来引起关注。由于病毒分离培养难度大,血清学诊断不能判定是否现症感染,且易混感其他疾病的特点,更增加了疾病的诊断难度,当前主要依靠分子生物诊断进行确诊,虽然 aMPV 分子生物学检测方法多样,但各有利弊,常规 RT-PCR 方法虽然检测速度快、特异性强,但不能定量,且检测敏感性不高。荧光RT-PCR 方法虽然克服了常规 RT-PCR 的缺陷,但仪器和探针的合成价格昂贵,检测成本比较高,不适合基层应用。LAMP 方法虽然简单、方便,适合基层进行推广应用,但灵敏度太高,易出现假阳性结果。

随着技术的不断发展,已经出现了免核酸提取荧光 PCR 扩增技术、便携式荧光 PCR 仪器及除模板外 PCR 组份冻干保存技术,如能应用于 aMPV 分子检测,必将开发出更方便、快捷、成本更低的病毒分子检测技术,方便疾病快速确诊,从而更好做好禽偏肺病毒病的防控工作。针对该病尚无有效的治疗方法,国内也无疫苗预防,确诊后只能对症治疗,从生物安全方面进行控制,加强饲养管理,提高禽类机体抗病力。禽舍定期通风、降低氨气浓度、减少饲养密度、减少应激以降低禽偏肺病毒发病率和病情的严重程度。

参考文献

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作者:李天芝1 ,于新友1 ,张颖2(1.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600 2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600)

责任编辑:曹伟胜

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