鸡白痢沙门菌检测技术进展

鸡白痢(PD)是全球性的家禽疾病,因其具有较高的死亡率和导致产蛋率下降,给全世界造成了巨大的经济损失。尽管各国都在采取多种策略来控制鸡白痢沙门菌的感染,但持续性的多重耐药和新型沙门菌变异仍对家禽养殖业造成了严重的威胁。近年来,鸡白痢在我国鸡群中流行仍较为严重,建立和筛选出准确而快速的检测方法成为鸡白痢沙门菌净化的核心问题。为此本文将对鸡白痢沙门菌的检测技术进展进行概述,以期为各养殖场制订和实施鸡白痢沙门菌净化措施提供参考。

1、前言

目前人类发现的沙门菌血清型已近 3 000个,其中鸡白痢沙门菌(Salmonella pullorum)在世界范围内广泛分布,尤其发展中国家面临着严重的威胁 [1] 。鸡白痢(Pullorum Disease,PD)是由鸡白痢沙门菌感染引起的不同品种、不同年龄鸡、火鸡的急性或慢性接触性传染性疾病,该病原还能感染鹌鹑、鸭、孔雀和珍珠鸡等其他禽类,且一经感染常终身带菌,有的鸡群死亡率甚至可高达 100%,对养殖业造成了严重的经济损失。本病既能垂直传播,也能水平传播,呈世界性分布。在许多发展中国家如墨西哥、阿根廷、印度、巴西和中国,它仍是禽类的主要威胁之一;在一些发达国家和地区,如美国、欧洲,因其普遍具有现代化的饲养设施及相对完善的疾病控制方案,鸡白痢较为少见,但仍难以完全根除 [2] 。PD 作为我国农业部要求重点净化的疾病之一,感染 PD 的鸡场难以仅通过药物预防和治疗来彻底清除该病。因此在严格生物安全基础上,实行定期检测并不断淘汰阳性鸡,是目前防控与净化鸡白痢最有效的措施。

PD 的确诊通常需要对鸡白痢沙门菌进行分离鉴定。目前包括我国在内的多个国家对该病的检测和诊断仍主要采用传统的细菌学方法,但细菌的培养分离操作步骤多,生化反应类型复杂,使得 SP 的检测过程显得较为繁琐、耗时、费力,日益不能满足迅速发展的家禽及其产品的贸易需求。1950 年以来,为了寻求更为简便、迅速且准确的检测方法,国内外学者在传统SP 检测方法的基础上进行了大量研究,建立了血清学、免疫学和分子生物学等多种检测 SP 的方法。

2、检测方法

2.1 细菌学检测

SP 为革兰氏阴性小杆菌,菌体大小为0.3~1.5滋m ×1.0~2.5滋m,常呈单个状,偶有两个或多个连在一起。该菌不形成荚膜和芽胞,需氧或兼性厌氧,且无鞭毛,不具有运动性。急性感染的鸡常为全身感染,常首选肝、脾和盲肠进行细菌分离,其分离率较高;有病变的心、肺、肌胃和卵黄囊等分离细菌也较可靠;慢性感染的鸡,可取正常或病变的内脏器官直接接种于牛肉汤(VI)琼脂和亮绿(BG)琼脂平板上,37℃培养48h [3] 。另外,参照食品安全国家标准 GB4789.4-2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》,先取内脏组织、粪便等样品于缓冲蛋白胨水(BPW)中 37℃摇动培养 8~18h 进行预增菌,再分别取 1mL 上述混合物转种于 10mL 四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB)和 10mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)中培养 18~24h 进行增菌,最后再取 1环增菌液划线接种于选择培养基上培养(包括BS 琼脂平板,XLD 琼脂平板或沙门菌属显色培养平板),观察菌落形态,呈典型沙门菌特征者继续进行革兰染色和显微镜观察。细菌学检测方法可直接根据菌落的形态特征分离并初步鉴定 PD,即使病料被严重污染,也能按菌落特征分离出来,且分离率较高 [4] ,值得注意的是国标法检测程序比较复杂,往往需要几天才能得出结果。

2.2 病理学检测

病理学检测或诊断 PD 主要是通过观察患病鸡的临床症状,并进行病理剖检。典型的 PD病死鸡呈败血症,鸡体瘦小,羽毛污秽,肛门周围黄白色粪便沾黏;病鸡脱水、眼睛下陷、脚趾干枯;大脑脑膜混浊,头颈扭转,共济失调、震颤等程度不一的神经症状;心肌结节增大,心包增厚,可见灰白色坏死点或小结节,心囊液增多;肝脏肿大,有点状出血或灰白色坏死点;胆囊肿胀充满胆汁;脾脏肿大,质脆易碎;肺脏可见坏死或灰白色结节;肾脏充血或贫血,输尿管显著膨大,有时在肾小管中有尿酸盐沉积 [5] ;肠道呈卡他性炎症,特别是盲肠常出现干酪样栓子,空肠回肠交界处可见卵黄吸收不全,内有直径约为 1mm的圆形淡黄色奶油样或干酪样固状物;关节肿大,常见跗关节内有黄色黏稠液体,翼关节内关节液增加并呈透明黏稠样等 [6] 。 病理学检测方法比较直观,临床上应用较多,值得注意的是最急性病例常表现突然死亡而没有明显病变,成年鸡感染 SP 多为隐性感染,需重点观察生殖器官的病变,若鸡群同时感染了其他细菌病和 / 或病毒病, 有可能出现相同或相似的症状,为此需结合其他方法相互印证,才能对 PD进行确诊。

2.3 生化特性检测

细菌的分离培养、生化鉴定及血清型分型一直是检测鉴定鸡白痢沙门菌的金标准 [7,8] ,另外鉴别同一血清型的鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌也多依靠生化鉴定。该方法是根据细菌各自的生化特性具有差异能够产生不同的生化反应来进行鉴定。传统的生化鉴定首先应挑取单个典型或可疑菌落接种于三糖铁琼脂(TSI)斜面,并进行底层穿刺,同时直接接种于赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,以对沙门菌进行初步判断,再挑取营养琼脂平板上的典型菌落,稀释成合适浊度的菌悬液,利用生化鉴定试剂盒或全自动生化鉴定仪进行鉴定 [9] 。得到的SP 应具有如下的生化特性:可发酵阿拉伯糖、葡萄糖和甘露醇,不发酵乳糖、蔗糖和水杨苷,不发酵卫矛醇,偶尔发酵麦芽糖,产酸、产硫化氢,V.P-、M.R 弱 +、吲哚 – 等 [10] 。生化鉴定是鉴别鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌有效可靠的方法,尽管两者生化反应的相同点多于不同点,但在实践中仍较为常用,值得注意的是有些菌株具有抗原变异的现象,故个别生化鉴定结果不唯一,特别体现在有无气体产生上。

2.4 血清学检测

血清学检测是利用抗原抗体能够特异性结合而形成丛状或凝集现象的一种检测方法。目前中国检测 PD 的唯一官方标准就是血清学方法中的凝集试验[11] ,包括全血平板凝集试验(PAT)、血清平板凝集试验(SPAT)、琼脂扩散试验(AGP)。此外酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金技术等,也具有廉价、可操作性强及快速的特点,故血清学方法在临床上应用较广泛。

2.4.1 全血平板凝集试验(PAT)

国内大部分鸡场检测 SP 时多采用全血平板凝集试验(Plate Agglutination Test,PAT),所用的凝集抗原为染色抗原。鸡和火鸡应在产蛋前进行试验,每年应进行多次检疫,严格淘汰阳性鸡及可疑反应鸡,以后每 3 个月重复检疫 1 次,直至连续 2 次均无阳性反应出现,可改为每 6个月或 1 年检疫 1 次。操作方法是:在无菌玻璃板上滴加 1 滴 PD 检测抗原液,并用采血环采集血液与抗原混匀,形成直径约 2cm 的液滴,在 20~25℃条件下观察凝集反应并于 2min 内判定结果。混匀后若立即出现大而明显的凝集颗粒,则为强阳性;若大小颗粒都有,或摇晃后才开始出现凝集颗粒,则为中阳性;若静置后才出现,且颗粒较小,或像流沙,则为弱阳性;若无凝集颗粒则为阴性 [12] 。检出的阳性鸡应全部淘汰,全血平板凝集试验对操作环境要求不高,简单易行且检出率较高,在生产实践中应用较多。值得注意的是全血平板凝集反应的诊断抗原更适用于产蛋母鸡和 1 年以上的公鸡,而对幼龄鸡敏感性较差;此外,一些与 SP 抗原相同或相近的细菌,如副伤寒沙门菌、大肠杆菌、微球菌及兰氏分类的 D 群链球菌等,它们占非白痢阳性反应的大部分,故容易错检;最后,鸡伤寒沙门菌与鸡白痢沙门菌感染难以用血清学试验进行区分,凝集试验主要用于检出带菌者,而对鸡白痢的确诊仍需做进一步的鉴定。

2.4.2 血清平板凝集试验(SPAT)

由于全血平板凝集试验的灵敏度具有一定的局限性,容易漏检抗体效价较低的阳性个体,因此血清平板凝集试验(Serum Plate Agglutina-tion Test,SPAT)也被广泛使用。蒋维维等 [13] 曾通过检测 1 万只鸡的血清和全血样品,发现血清样品 PD 的阳性检出率普遍高于全血平板凝集试验的阳性检出率;晏志勋等 [14] 通过对比全血与血清平板凝集试验检测 PD,发现血清平板凝集试验的阳性检出率高于全血平板凝集试验,且利用 SPAT 检出的阳性个体包含了全血平板凝集试验检出的全部阳性个体,认为在 PD 净化过程中,血清平板凝集法的敏感性高于全血平板凝集法。其操作方法与全血平板凝集试验大致相同,只是多了析出血清这一步。SPAT 较全血平板凝集方法特异性更强,阳性检出率更高,稳定性更好,因此采用 SPAT 更有利于 PD 的净化。值得注意的是 SPAT 相对全血平板凝集试验而言,操作更为复杂,工作量增加,时间延长,因此对于规模较大的种鸡场,可在 PD 净化初期,考虑采用全血平板凝集的方法,当阳性比例降低到较低水平或后期检不出阳性个体时,再采用血清平板凝集方法进行检测,也可在某个特定阶段或某些核心鸡群中采用血清平板凝集试验的方法,来加速鸡白痢的净化。

2.4.3 卵黄抗体检测法

卵黄抗体检测法实际是利用卵黄提取物取代全血或血清来检测 PD,其方法与平板凝集试验相似,但能够避免采血对鸡群造成应激,操作简单、反应迅速,值得注意的是其卵黄抗体滴度和 PD 的阳性检出率稍低于血清和全血平板凝集试验,同时卵黄液不易被稀释均匀 [15]

2.4.4 琼脂扩散试验(AGP)

琼脂扩散试验(Agar Gel Diffusion Precipita-tion, AGP) 是利用可溶性抗原与抗体特异性结合后在琼脂凝胶中形成沉淀线, 以此来检测抗体的效价或鉴定、区分抗原的一种技术。AGP对操作环境要求不高,能在试管里、平皿中和玻片上的琼脂中进行,AGP 可分为单向琼脂扩散和双向琼脂扩散两大类。检测 PD 常利用双向琼脂扩散,采用六孔梅花型,中心孔添加 PD 抗原,周围孔分别添加阳性、阴性及待检血清,37℃培养 48h 后若出现白色沉淀线则为阳性,若无沉淀线则为阴性。AGP 操作简单、所用仪器少、结果易判断,已成为临床上疾病诊断、抗体检测应用较广的实验方法之一,在生产中AGP 应用也较多。李淑娟等 [16] 通过对比全血平板凝集试验和琼脂扩散试验对 PD 进行检测,发现 AGP 与全血平板凝集试验的阳性符合率为 100%, 且检出率高于全血平板凝集试验,在检测 PD 中敏感性较高,值得注意的是进行AGP 时应遵守其操作要点,避免抗原抗体及反应环境等因素影响结果的准确性。

2.4.5 酶联免疫吸附法(ELISA)

酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Im-munosorbent Assay,ELISA)是利用酶标包被板使抗原抗体特异性结合并显色的一种诊断技术,能特异性地检测 PD,具有灵敏、快速和便捷的特点。徐耀辉等 [17] 利用 HRP 标记沙门菌 O9 单抗与包被的鸡白痢沙门菌 LPS 抗原建立了一种单抗阻断 ELISA 方法。该方法基于 LPS 与待检血清样品抑制酶标单抗的结合,对已知鸡白痢阳性血清、阴性血清以及 SPF 鸡血清进行检测,结果表明该方法能够在人工感染 PD 后第 2周全部检出针对该菌的特异性抗体,比传统的PAT 方法早 1 周检出。ELISA 方法具有 1 次可检测大批量样本的优点,尽管市场上沙门菌的检测试剂盒较多,在生产中应用也较广泛,但目前还没有比较成熟的 ELISA 检测试剂盒能针对 PD,仍需要检出沙门菌后做进一步的血清分型或生化鉴定来确诊鸡白痢沙门菌。

2.4.6 电化学酶免疫传感器

电化学酶免疫传感器是利用酶的高效性、电化学的放大作用与免疫反应相结合,使其检测效果优于普通传感器的检测方法。Yiheng Luo等 [18] 利用血糖仪(PGM)监测葡萄糖的消耗量建立了一种定量检测鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的电化学方法,通过利用具有抗体功能的磁性纳米粒子 (IgG-MNPs)来捕获、富集鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,分别形成 IgG-MNPs-S.P和 IgG-MNPs-S.G,再将多克隆抗体和高含量的葡萄糖氧化酶装载于氨基化的二氧化硅纳米颗粒上形成 IgG-SiNPs-GOx,添加于上述混合物中形成夹心复合材料分散于葡萄糖溶液中,利用 PGM 测定葡萄糖水解前后的浓度即可检测鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌。该方法在最佳检测条件下,葡萄糖浓度的降低与 SP、SG 的对数呈线性关系,其线性响应范围为 1.27×102 至1.27×105 CFU/mL,检出限为 7.2×101 CFU/mL。

2.4.7 核酸探针技术

核酸探针技术是利用核苷酸碱基序列互补的原理,用同位素、生物素等标记己知核苷酸序列 DNA 片段中的单链分子,再加入已变性的待检样品,形成杂交双链,从而鉴定样品 DNA,这种能特异性识别有标记的单链 DNA 分子称为核酸探针或基因探针 [19] 。传统的同位素标记探针半衰期短且对人体危害较大,近年来改进后的生物素标记探针操作安全、可重复使用、具有较高的稳定性,且诊断快速,3h 就可出结果。但由于它容易出现非特异性显色,重复性差,操作复杂等问题,目前可能更适合于实验室检测,在基层运用较少。

2.4.8 胶体金技术

胶体金技术是一种特异性好、操作简单、结果显示迅速的新型标记技术。它包括斑点免疫金渗滤法(DIGFA)和胶体金免疫层析试纸条法(GCIA)。

2.4.8.1 斑点免疫金渗滤法(DIGFA)

斑点免疫金渗滤法(Dot Immunogold Filtra-tion Assay,DIGFA)是利用微孔滤膜吸附蛋白质,使抗原抗体快速结合形成免疫复合物, 并以胶体金为标记物,使胶体金瞬时显色的检测方法。曹春梅等 [20] 将鸡白痢沙门菌的 LPS 抗原包被于渗滤盒检测区(T 区),针对沙门菌 O9 抗原单克隆抗体 3-47-O 包被在质控区(C 区),用胶体金标记 PD 的 LPS 抗原, 建立了一种抗原夹心法DIGFA 来快速检测 PD 抗体。若 C 区和 T 区均出现清晰的红色圆点则为阳性, 若仅 C 区出现红色质控圆点则为阴性。与玻板凝集试验对比,DIGFA 灵敏性更好,阳性检出率更高,且试剂和样本用量少,反应速度快,也没有放射性同位素等有害物质参与,无需借助荧光显微镜、酶标检测仪等仪器,试剂便于保存、携带和运输,如能进一步完善和商业化后,则有望在基层开展诊断、现场调查和免疫监测工作中发挥作用。

2.4.8.2 胶体金免疫层析试纸条法(GICA)

胶体金免疫层析法(Gold ImmuneChromato-graphic Assay,GICA)是上世纪 90 年代初期发展起来的以胶体金为标记物的简便、快速的检测方法 [21] ,曹春梅等将抗沙门菌 O9 抗原的特异性单克隆抗体 4-7-7、羊抗鼠 IgG,以条带状分别包被于硝酸纤维膜的检测区(T 区)和质控区(C 区)上,用胶体金标记另一株单抗 3-47-O,并将其吸附于金标垫上,制成试纸条。经人工感染试验,发现该试纸条可直接从肝脏、脾脏和粪便拭子中检测到沙门菌 O9 抗原,且该方法与 SPA阳性符合率达 80%以上;刘志科等 [22] 用胶体金溶液标记山羊抗鸡 IgY, 并将鸡白痢的 invA 融合蛋白与鸡 IgY 包被于 NC 膜上分别作检测线和质控线,利用该方法对 195 份血清样品进行检测,结果显示 GIGC 与 PAT 符合率为 96.43%。该方法简单、快速、特异及可单份测定,无需任何仪器设备和很专业的技术人员。

2.5 分子生物学检测

常用的 PD 分子生物学检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)、多重 PCR、高分辨率熔解曲线(HRM)及环介导等温扩增技术(LAMP)等。

2.5.1 PCR 检测方法

2.5.1.1 直接 PCR 检测法

与传统的 PD 检测方法相比,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)具有快速、灵敏和特异等优点,特别在高通量筛选下,有助于沙门菌血清学分型。Xiong D 等 [23] 根据PD 鞭毛上特异的 flhB 基因建立了一步法PCR,通过对 27 种不同血清型的沙门菌及 8 种非沙门菌进行检测,结果显示 SP 能显示出 1 条大小为 182bp 的特异性条带,且该方法能检测到的最小 DNA 浓度为 5.85pg/滋L, 最小细菌量为 10CFU。张童利等 [24] 通过对 GenBank 中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的全基因组进行生物学分析,确定了以 SEEP17495 基因来检测 SP,结果显示仅 SP 能扩增出 1 条大小为 356bp 的特异性条带,且该方法能检测到SP 的最小菌液浓度为 103 CFU/mL,其他血清型的沙门菌及其他常见的非沙门致病菌扩增结果均为阴性。Xu L 等[25]对中国 1962-2016 年间650 株 SP 分离株进行研究,发现其中 644 株均具有 ipaJ 基因,其余 6 株因缺乏 pSPI(毒力岛)12 为阴性,并以此构建了 SP 的快速 PCR 方法,能特异性地扩增出 1 条大小为 741 bp 的目的条带,该方法能够良好地区分鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌,并具有较高的特异性和灵敏性,能检测到的最小 DNA 浓度为 90 fg/滋L,最小细菌量为 102 CFU。虽然 PCR 技术发展迅速,但目前似乎还难以在基层中广泛使用,一方面可能是因为需要专门 PCR 仪,另一方面可能是因为其具有较高的灵敏性,微量的污染即能影响检测结果。

2.5.1.2 多重 PCR 检测法

与直接 PCR 相比,Chamberian 等 [26] 提出的多重 PCR 方法能够在同一反应中同时检测多个目的基因,可以简化操作步骤,减少污染概率,提高检测的实效性,是一种更为简便、快速、敏感性高的诊断方法。Xiong D 等 [27] 利用 3种特异性基因(tcpS、lygD、flhB,其中 tcpS 存在于都柏林、肠炎、鸡白痢 / 鸡伤寒沙门菌中;lygD 仅存在于肠炎沙门菌中;flhB 仅存在于鸡白痢 / 鸡伤寒沙门菌中)建立了多重 PCR 方法,该方法能检测到 SP 的最小 DNA 浓 度 为58.5pg/滋L;杨帆等 [28] 以沙门菌属、鸡白痢沙门菌和肠炎沙门菌的特异性基因(invA、fliC、sdfI)设计引物,通过优化反应条件,其回收产物可分别在 304bp、600bp、706bp 处获得对应的特异性条带;杨林等[29]根据沙门菌属特异性基因(hut、495bp)、肠炎沙门菌(SdfI、304bp)、鼠伤寒沙门菌(Spy、401bp)、鸡白痢沙门菌(glgC、252bp)、鸡伤寒沙门菌(glgC、252bp 和 speC、174bp)的血清型特异性基因分别设计引物,建立了 mPCR 方法,可同时检测鉴定肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及鸡伤寒沙门菌,其中检出SP 的敏感性、特异性和符合率分别为 100%、94.6%和 96.4%,最小细菌量为 3×103 CFU,最小 DNA 浓度为 214pg/滋L。

2.5.1.3 套式 PCR

套式 PCR 是在原有的 PCR 技术上再增加一条引物,使其灵敏性比常规 PCR 高 [30] 。刘志科等 [31] 根据沙门菌侵袭蛋白基因 invA 的高度保守区域,设计 2 对特异性的套式引物,并提取SP 的 DNA 为模板克隆 invA 基因,优化 PCR 反应条件,建立了快速、简便、高效的 SP 套式PCR 检测方法。通过进行灵敏性和重复性实验,结果显示套式 PCR 在模板浓度为 10 CFU/滋L时可扩增到 SP 的目的条带,其灵敏性比常规PCR 高 10 000 倍。但套式 PCR 也有其不足之处,就是容易出现模板污染和假阳性结果。

2.5.1.4 实时荧光定量 PCR

实时荧光定量 PCR (Quantitative Real TimePCR,qPCR),是基于普通 PCR,使用针对扩增DNA 的荧光物质,对 PCR 的进程进行实时监测,使 DNA 的数量与荧光强度呈线性关系,从而获得标准曲线,并对未知模板进行定量分析的一种检测方法。张童利等 [32] 通过制备检测 SP目的片段的重组质粒标准品,建立了 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法检测 SP 的最低检测限为 34fg/滋L,通过对模拟样品进行检测,结果显示该方法与传统细菌分离方法相比符合率为97.2%;Marcela da Silva Rubio 等[33]利用 SYBRGreen I 染料并设计引物 pSGP,建立了可鉴别诊断鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌的多重qPCR 方法,能够特异性检测 PD,结果显示该方法可以检测到 101 到 108 CFU 的鸡白痢沙门菌,表明其敏感性和特异性均高于普通 PCR,另外,该 PCR 过程是全封闭的,无需进行后续处理,值得注意的是该方法对引物的特异性要求较高,还要注意避免荧光染料与非特异性双链DNA 结合,否则易造成假阳性。

2.5.2 高分辨率熔解曲线(HRM)

高分辨率熔解曲线(High-Resolution Melt-ing,HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术 [34] 。通过在 PCR 体系中加入饱和染料,加热PCR 扩增产物,反应后的荧光染料与双链 DNA结合,且 DNA 双链随温度的升高逐渐解离,导致荧光分子逐渐失去荧光信号,检测器通过记录荧光的变化过程对数据作图,以温度变化为横坐标,以荧光信号变化为纵坐标生成熔解曲线。Ren X 等 [35] 利用鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌 rfbS 基因在 237 位点和 598 位点的规律性变化,设计引物并成功建立了鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌 PCR-HRM 检测方法,该方法特异性为 100%,最低检测限分别为 34 copies/滋L 和42 copies/滋L,灵敏度是普通 PCR 的 100 倍以上,具有快速高效、低成本和高通量的特点,整个过程呈闭管操作且 PCR 产物无需再转入其他装置,避免了交叉污染,为家禽中鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的快速诊断和净化提供了可靠的方法。值得注意的是该方法要求 PCR 仪孔间温度差低于 0.2℃,而目前有些常规 PCR 仪不一定能达到该要求,暂时难以在基层推广。

2.5.3 环介导等温扩增技术(LAMP)

环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是 Notomi 等 [36] 发明的一种较新颖的恒温核酸扩增方法。和传统PCR 相比,LAMP 不需要进行高温变性过程,可直接通过肉眼观察结果。不仅降低了对实验仪器的要求,同时能节省时间,降低了使用同位素带来的污染,还可实现高通量检测 [37] 。Fan 等 [38]构建了一种检测组织沙门菌的 LAMP 方法,在细菌低拷贝数的前提下,其灵敏度比 RT-PCR高 10 倍,同时还缩短了 3h 的检测时间,大大提高了检测的灵敏度。但该技术也存在一些缺点,如对引物设计要求较高、具有较高的假阴性率、对目标靶序列长度要求短等,暂时不适宜在鸡场等基层推广。

3、小结

鸡白痢沙门菌不仅严重制约了我国肉种鸡和蛋鸡的种业健康发展,而且还造成了巨大的经济损失和环保压力,为此鸡白痢的诊断和净化显得尤为重要。国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020 年)》提出,2015 年全国祖代以上种鸡场的鸡白痢沙门菌病应达到净化标准,2020 年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门菌病应达到净化标准;农业部印发的《全国蛋鸡遗传改良计划(2012-2020)》和《全国肉鸡遗传改良计划(2014-2025)》也要求严格净化鸡白痢这种垂直传播疫病。需要强调的是,为社会提供优质无鸡白痢沙门菌污染的种鸡苗,也是各种鸡场应承担的主体责任。为推动早日实现这些目标,各种禽场应充分认识各种检测方法的优缺点,并结合企业自身的实际技术水平,筛选合适的净化检测方法,制订科学合理的鸡白痢净化方案,并在行动中不断调整优化,最终建立无鸡白痢沙门菌感染的种鸡场。

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作者:晏玲,曹伟胜*(华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,农业部人兽共患病重点实验室,广东省动物源性人兽共患病重点实验室,人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室,广州 510642)

基金项目 : 广东省家禽产业技术体系(2016LM1114); 国家肉鸡产业技术体系(CARS-41-G16) * 通讯作者:caoweish@scau.edu.cn

责任编辑:曹伟胜

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