禽流感 （Avian Influenza,AI），是指由 A 型流感病的一种病毒（也称禽流感病毒）引起的一种家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的高度接触性的人畜共患传染病，分为高致病性和低致病性两种，低致病性以 H9亚型禽流感为主[1] 。目前，国内养鸡场常用 F、SS 等类 BJ94 的疫苗株，能起到一定的预防效果，但未能达到 100%完全保护，因此，H9 亚型禽流感仍常有发生[2] 。2015 年冬，江西某鸡场的肉鸡群出现咳嗽、呼吸困难的发病症状。本试验从发病肉鸡群中采样，经病毒分离鉴定，确定为 H9 亚型禽流感病毒。对分离株的 HA 基因进行测序和分析，并与近年来流行的 H9 亚型禽流感毒株和部分常用疫苗毒株 HA 基因、蛋白质序列进行相似性比较和分析，旨在从分子水平上了解江西地区 H9 亚型禽流感病毒毒力的特点，为该病的预防和控制提供理论依据。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料样本
2015 年冬采集江西地区某鸡场的发病肉鸡群的喉拭子和肛拭子。
1.1.2 试验动物
9~10 日龄 SPF 鸡胚由广东永顺生物制药股份有限公司提供。
1.1.3 试剂
抗 H5 亚型禽流感病毒、抗 H7 亚型禽流感病毒、抗 H9亚型禽流感病毒血凝抑制试验用阳性血清，抗新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）血凝抑制试验用阳性血清，抗减蛋综合症 （Egg Drop Syn-drome Virus,EDSV）血凝抑制试验用阳性血清均由广东省动物防疫监督总所提供；TakaraMini Best Viral RAN ExtractionKit、DNTP、RNA 酶抑制剂、随机引物、Ex Taq 聚合酶及其Buffer、dNTP、DL2000 Marker为 TaKaRa 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 病毒的分离与传代
将发病肉鸡群的喉拭子和肛拭子置于于 -40℃ 低温冰箱中反复冻融 3 次，4 000 rpm 离心 5 min，吸取上清液，用 0.22滋m 细菌滤器过滤除菌，保留滤液。滤液以每胚 0.2 mL 的剂量接种于 9~10 日龄鸡胚尿囊腔中，37 ℃ 恒温培养。每日观察 3 次。弃去 24 h 内死亡的鸡胚，24h 后死亡的鸡胚随时取出，放于 4 ℃。孵育至 96 h 后全部取出，放置在 4 ℃ 过夜。观察死亡鸡胚的病变。收取鸡胚尿囊液，作无菌检查，然后连续传代。
1.2.2 血凝试验和血凝抑制试验
参照文献 [3] ，配置 1%鸡红细胞悬液，取分离株鸡胚尿囊液进行微量血凝试验。然后具有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与新城疫病毒、减蛋综合征病毒和 H5 亚型、H7 亚型、H9 亚型禽流感病毒的标准阳性血清进行微量血凝抑制试验。
1.3 基因型鉴定
1.3.1 引物设计
根据该毒株的初步实验结果，从 GenBank 上获取多株H9 亚型禽流感病毒基因序列分析比较 ，使 用 DNAStar（Verison7.1） 和 Oligo 6，针对HA 基因核苷酸序列的保守区域设计了 1 对用于扩增包含HA 基因的核苷酸片段的特异性引物，送至上海英骏生物有限公司按照合成。引物序列如下，通用反转录引物：Uin12：5’-AGCAAAGCAGG-3’； HA1：5’-AGCAAAAGCAGGGG-3’，HA2：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTT-3’，预计扩增 1 700bp。
1.3.2 RT-PCR 反应
用 Takara Mini Best ViralRAN Extraction Kit 提取分离株鸡胚尿囊液的病毒总 RNA，用随机引物为反转录引物合成cDNA，再用针对 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因所设计的特异性引物进行 PCR 扩增检测，将RT-PCR 扩增产物电泳检测结果。
1.3.3 序列测定和分析
PCR 扩增产物经回收后送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行序列测定，运用 DNAS-tar 的 Lasergene v7.1 软件包中的 Seqman 和 Editseq 软件对目的基因序列的进行拼接后，把获得的序列提交 NCBI BLASTSERVER 进行检索。运 用DNAStar 软件分析 HA 裂解位点的氨基酸序列、蛋白受体结合位点、以及潜在的糖基化位点，并运用 Mega7.0 软件的neighbour-joining 方法绘制毒株的系统进化树。从 GenBank上获取近几年来流行毒株的HA 基因核苷酸序列和 SS 株、F 株等疫苗毒株的 HA 基因核苷酸序列（见表 1），加上本试验分离株的相应序列，使用DNAStar 软件包中 MegAlign 程序中 Clustal W 方法对本试验测定毒株和参考毒株序列的核苷酸和推导氨基酸的相似性分析。
2、结果
2.1 病毒分离和传代
经处理的病料接种 9~10日龄 SPF 鸡胚，96h 内鸡胚未出现死亡，收获冻死鸡胚尿囊液，无菌检查为阴性。
2.2 血凝试验和血凝抑制试验
分离株的鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞，表明其对鸡红细胞具有血凝性，血凝效价（HA）为 1：1 024。用减蛋综合征病毒、新城疫病毒和禽流感病毒H5 亚型、H7 亚型、H9 亚型标准血清进行 HI 试验结果分别为 <1:2；<1:2；<1:2；<1:2 以及1:512，证明分离得到的病毒株为禽流感病毒 H9 亚型，命名为 A/chicken/Jiangxi/WS-JX/2015（简称 WS-JX）。
2.3 RT-PCR 扩增结果
利用特异性引物对WS-JX 株 的 RNA 进 行RT-PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得与预期大小一致的条带（见图 1）。
M：DL2000marker; 1. 分离株 HA 基因的 RT-PCR 产物
2.4 HA 基因序列的测定及遗传进化分析
将 WS-JX 株的 HA 基因序列上传至 NCBI Blast，比对结果显示其与 GenBank 上的ZS03 株的核苷酸序列相似性最高，达 到 99.6% 。 运用DNAStar 软件对 WS-JX 株的HA 基因进行核苷酸序列分析，结果表明 HA 序列含有一个长度为 1 683 个核苷酸的阅读框架，预计编码 560 个氨基酸。根据序列测定的 HA 序列所推导的氨基酸序列分析显示，WS-JX 株的 HA 蛋白中含有 29NST、141NVS、298NTT、305NVS、 313NCS、 492NGT、551NGS 这 7 个潜在的糖基化位点。受体结合位点的氨基酸分 别 为 109Y、161W、163T、191N、198T、202L、203Y，而第226 位氨基酸位 L，为哺乳动物受体结合位点的特征氨基酸 [4] 。裂解位点（335-343 位）的氨基酸序列为 PSRSSR GLF，裂解位点附近均无连续碱性氨基酸插入，仅能被有限的细胞蛋白酶识别，符合低致病性 AIV 的分子特征 [5, 6] （见表 2）。基于WS-JX 株与 GenBank 中的 H9亚型 AIV 参考毒株、国内常用疫苗株以及近年来流行毒株的HA 基因核苷酸序列，利用MEGA7.0 软件绘制系统进化树（见图 2）。遗传进化分析结果表明，WS-JX 株属于 4.2.5分支，与 ZS03 株的亲缘关系最近，与 DG4254 等近年来流行毒株处于同一进化分支；而国内常用疫苗株 F、SS 与 BJ94 株同属 4.2.3 分支。分离的WS-JX 株所处的 4.2.5 分支同属 4.2 这一大分支，但 2 个分支之间有一定的遗传距离 [7,8] 。
2.5 HA 基因核苷酸和氨基酸序列相似性分析
利用 DNA Star 软件包中的 MegAlign 软件对 WS-JX 株的 HA 基因核苷酸、蛋白质氨基酸序列与从 GenBank 上获取毒株的相应序列进行相似性比较。结果表明，WS-JX 株 HA基因核苷酸序列、蛋白质氨基酸序列与 GX55 株等国内近年流行的 4.2.5 分支 H9 亚型禽流感病毒的相似性较高，分别为 90.1%~99.6%和 94.1%~100.0%，而与国内常用疫苗株 F、SS 等 4.2.3 分支毒株的相似性较低，分别为 85.9%~89.1%和90.6%~90.9%。由此可见，同属4.2 这一大分支的 WS-JX 株和F、SS 株等常用疫苗株分别处于 4.2.5 分支和 4.2.3 分支，这两个分支存在有一定的遗传距离。
3、讨论
3.1 WS-JX 株的分离与鉴定
本试验从发病肉鸡群中分离得到 WS-JX 株，它对鸡红细胞具有血凝性，而凝集可被 H9亚型 AIV 标准阳性血清所抑制，测序结果分析显示，WS-JX株的 HA 蛋白裂解位点的氨基酸序列为 PSRSSR GLF，符合低致病性毒株的分子特征，证明 WS-JX 株为低致病性 H9亚型 AIV。
3.2 HA 基因分析
裂解位点、受体结合位点和抗原位点都位于血凝素 HA蛋白中，选用 HA 基因来分析H9 亚型禽流感病毒的致病性、宿主特异性、抗原性以及遗传变异等情况，可得到较为可靠的分析结果。受体结合位点方面，WS-JX 株及近年来的流行株 HA 蛋白的第 226 位氨基酸上发生了突变，谷氨酸 Q→亮氨酸 L，因而呈现出典型的人流感病毒受体结合特性，这一现象提示 H9 亚型禽流感病毒更容易感染人类而不再需要通过在宿主上适应这一过程，在未来可能对公共卫生安全构成巨大的威胁 [9] 。在潜在的糖基化位点，WS-JX 株相比 F、SS 等疫苗株发生了 T220I、P315S 等突变，导致缺少 218NRT 潜在糖基化位点，而增加 313NCS潜在糖基化位点。然而这两个突变对于抗原性有多大影响，目前尚未清晰。基于 WS-JX 株HA 基因序列的系统进化树表明，WS-JX 株属于 4.2.5 分支，而国内常用疫苗株 F、SS 株与BJ94 株同属 4.2.3 分支 ，WS-JX 株所处的 4.2.5 分支和疫苗株所处的 4.2.3 分支虽同属于 4.2 这一大分支，但两个分支之间有比较明显的遗传距离和差异。本次试验分离得到的 WS-JX 株和当前的流行株类似，均与疫苗株有一定的核苷酸、氨基酸序列以及抗原性差异，当前使用的疫苗株不一定能够 100%对鸡群产生保护。
3.3 H9 亚型禽流感的防控
近年来，由于 H9 亚型禽流感灭活疫苗的广泛使用，导致病毒变异的速度加快，尤其是 HA 基因发生了较大变异，引起病毒抗原性的改变，导致现有疫苗株与当地流行毒株抗原性不完全相符，从而使目前使用的疫苗保护作用下降，造成免疫鸡群仍可发病和流行，或者处于带毒潜伏期 [10] 。当然，H9 亚型禽流感的防制，不能单靠疫苗免疫预防，要结合隔离、消毒等生物安全措施以及规范管理来综合防控。但当前一些肉鸡场的 H9 亚型禽流感的暴发和流行，却不能够完全归结为因抗原性改变、毒株变异而引起现有的疫苗对禽群的不完全保护。在多数情况下，管理水平、饲养环境和免疫失误等原因也会造成疾病的暴发。毕竟商品肉鸡生长周期短，免疫器官发育尚未成熟，接种灭活疫苗并未能迅速产生有效保护力，加上灭活疫苗主要诱导机体产生循环抗体，免疫鸡群可能缺乏足够的分泌型抗体，从而对黏膜的保护效果较低。如果饲养环境差，病原复杂，管理水平低，应激因素多，均会加重疫情。因此，应加强鸡群饲养管理和防控力度，并适当结合应用有效的优质灭活疫苗（含有4.2.5 分支毒株）进行补免，这样可提高与野毒相对应的抗体，进一步减少带毒和排毒，降低鸡群因抗体下降而被野毒反扑导致发病的机会，这些都有可能减少 H9 亚型禽流感的发生，或者降低其危害。
参考文献
[1]. 蔡扩军,成进. H9 亚型禽流感的危害与防控. 兽医导刊,2016(09): 22-24.
[2]. 张晓娟,刘缓缓,王俊亚,等.河南部分地区 H9 亚型禽流感病毒的分离鉴定及交叉免疫攻毒保护试验. 中国农学通报,2012(26): 67-70.
[3]. 黄艳羚, 孙淑兰. 血凝(HA)—血凝抑制(HI)试验操作要点.湖北畜牧兽医, 2016 (12): 22-23.
[4]. 郭元吉,李建国,程小雯,等.禽 H9N2 亚型流感病毒能感染人的发现. 中华实验和临床病毒学杂志, 1999(02): 5-8.
[5]. Rohm, C., et al. Do hemagglutinin genes of highly pathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? Virology,1995. 209(2): p. 664-70.
[6]. Lin, Y.P., et al.,Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses: relationship between H9N2 and H5N1 human isolates.Proc Natl Acad Sci U S A, 2000.97(17): p. 9654-8.
[7]. 尚飞雪,刘朔,蒋文明,等. 近年来中国 H9 亚型禽流感分离株谱系分析. 中国动物检疫,2012(04): 51-53.
[8]. Jiang, W., et al. Chinese and global distribution of H9 subtype avian influenza viruses. PLoS One, 2012. 7(12): p. e52671.
[9]. 陈瑞爱,赖汉章,贺东生,等.20 株鸡源 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 基因的变异分析, 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会 2012: 1.
[10].张慧琴. 高致病性禽流感的流行现状及防控措施. 当代畜禽养殖业, 2016(07): 62.
作者：何柳芬1钟植文1黎先伟1刘镇明2杨傲冰1（1.广东永顺生物制药股份有限公司，广州 511356；2.华南农业大学兽医学院，广州 510642）
作者简介：何柳芬，硕士，从事家畜家禽传染病学研究 通讯作者：杨傲冰，E-mail：yangaobing@126.com
