血凝抑制试验单位抗原的配置方法探讨

血凝抑制试验在禽流感和新城疫的防控中有着重要的作用, 该方法的影响因素很多,4 单位抗原就是其中一个重要的因素。本文通过 比较不同的 4 单位抗原配置方法、校对方法,探究如何又快又准地配置 4单位抗原。试验表明,通过稀释法测得的 4 单位抗原效价更加准确,多重校对法可以直接推算出微调的方法,保证二次校对的准确性,对基层兽医实验室工作者有着重要的意义。

血凝抑制试验是检测禽流感和新城疫抗体水平的主要方法,在基层动物疫病防控中心实验室中有着广泛的应用。但是,该方法受较多因素的影响,结果常有较大偏差,其中 4 单位抗原的配置是困扰基层实验室工作者的最大问题。本实验将新城疫试验抗原按不同倍数稀释后,测得其平均效价,配置而得的 4 单位抗原较准确;并且本文介绍了多重校对法,可以直接推算出微调抗原的方法,为 4 单位抗原的配置和校对节省了较多时间,对基层实验室工作者有较大的帮助。

1、材料

1.1 试剂

鸡新城疫病毒血凝抑制试验抗原(中国兽医药品监察所,批号: 201611)、1%鸡红细胞悬液、PBS溶液(0.1 mol/L,pH 值 7.2)。

1.2 仪器设备及耗材

微量振荡器(江苏省金坛市医疗器械厂)、96孔 V 型反应板、8 道或 12 道移液器(10~100μL)、移液器滴头(美国 Axygen)、加样槽等。

2、方法

2.1 抗原的效价测定

2.1.1 原倍法直接测量抗原的效价

将 25μL 新城疫抗原依次倍比稀释,测定原倍抗原的血凝效价,具体见血凝试验[1]

2.1.2 稀释法测抗原的平均效价

将新城疫抗原按照原倍(1)、1/3、1/5、1/7 倍进行稀释,分别测量抗原效价,具体见血凝试验[1]。按照公式测定抗原效价的平均值,从而准确地测量抗原的效价。

2.2 4 单位抗原的配置

分别按原倍法和稀释法测的抗原配置 4 单位抗原,抗原的效价值除以 4 即为稀释倍数[2]

2.3 4 单位抗原的校对

2.3.1 直接校对法

将 25 μL 的 4 单位抗原用 PBS 等量倍比稀释,使每孔含有 2 HAU、1 HAU、0.5 HAU、0.25 HAU(见图1,1~5 孔),每孔补加 25μL PBS,再加入 1%红细胞悬液[2]

2.3.2 多重校对法

在直接校对法的基础上,增加 6~10 孔的操作。即 6 孔中加入 50 μL PBS,将 25 μL 的四单位抗原用 PBS 等量倍比稀释(6 孔弃去 25 μL PBS,保证体系一样),使每孔含有 4/3 HAU、2/3 HAU、1/3 HAU、1/6 HAU(见图 1,1~10 孔),每孔补加 25 μL PBS,再加入 1%红细胞悬液[2]

3、结果

3.1 抗原效价的测定

原倍法直接测量新城疫抗原的效价为 8(如表 1)。

稀释法分别测原倍、1/3、 1/5、1/7 倍的效价为:28、26、25、 24,可以按照表 1 计算抗原的平均效价为 27.49,则该抗原的平均效价为 180。

3.2 4 单位抗原的配置及校对

根据原倍法测得的抗原效价,抗原做 64(256/4)倍稀释即可得到四单位抗原;而稀释法将抗原 45(180/4)倍稀释。然后对 2 种方法配置的 4 单位抗原进行校对,结果原倍法配置的 4 单位抗原偏小,出现 1、6 孔完全凝集,其他孔有不同程度的拉线;而稀释法配置的抗原如图 1 所示,较标准。

3.3 4 单位抗原的微调

由于原倍法配置的 4 单位抗原偏小,需进行微调,经推算需再加入 1/3 的抗原。再次用多重法进行校对,则出现图 1 的结果,说明微调后的 4 单位抗原较准确。

4、讨论及结论

4 单位抗原是血凝抑制试验的重要环节,其准确性对试验结果有重要的影响。抗原浓度高时,HI 抗体效价就会降低;反之则会有所升高。抗原效价测量是否准确,决定了配置而得的 4 单位抗原准确性。稀释法测定而得的抗原效价通过稀释多次测量获得抗原的平均值,其结果更加接近准确值。

4 单位抗原需现配现用,且用之前要进行校对,保证其准确性[3]。按照直接法校对的 4 单位抗原只能判定配置结果是否准确,针对校对结果不准确, 并没有好的方法,许多文献[4,5] 均说明要进行微调后进行校准,但是均未说明如何微调。而多重校对法,能够准确地计算出需加入的抗原(PBS)的量, 保证了微调后的 4 单位抗原的准确性。最多 2 次校对即可准 确地配置好 4 单位抗原,避免了反复校对,影响血凝抑制试验的进度,具有较大的参考意义。

参考文献

[1] GBT 16550-2008 新城疫诊断技术[S].

[2] SNT 1182-2010 禽流感检疫技术规范[S].

[3] 顾小明. 家禽血凝试验及血凝抑制试验的操作方法及注意事项 [J]. 中国畜牧兽医文摘. 2016,32(8):50.

[4] 常磊,孙娅莉,吴德喜,等.血凝和血凝抑制试验的影响因素 [J]. 中国家禽 .2011,33 (16): 57-58.

[5] 丰春燕. 影响禽流感血凝和血凝抑制试验的因素分析 [J] . 中国畜牧兽医文摘. 2016,32 (12):55.

作者:任义品1、韩渝濠2( 1.河南省漯河市动物疫病预防控制中心河南漯河 ,462000; 2.普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳 471000 .)

责任编辑:徐成刚

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