鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

鸡大肠杆菌病是由某血清型的致病性埃希氏大肠杆菌 (avian pathgenicity E.coli, APEC)引发的细菌性传染性疾病,临床上常见的有急性败血症、气囊炎、腹膜炎、卵巢炎、输卵管炎、脐炎和肉芽肿等病型。病死率高达 70%~100%。

本试验对安阳县某鸡场发生的疑似患有鸡大肠杆菌病的发病鸡进行了临床初步诊断,无菌操作采取病死鸡的脾脏、肝脏、淋巴结以及十二指肠作为典型病料进行病原菌的显微镜观察,分离培养、生化试验、 血清型鉴定,确定分离的病菌为大肠杆菌。最后通过药敏试验鉴定出对大肠杆菌敏感的药物作为以后治疗与预防的理论依据。现将有关情况报道如下。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

从安阳县某鸡场,无菌操作采集发病鸡的肝、脾、淋巴结以及十二指肠作为病料。

1.1.2 大肠杆菌分离株

本试验所用的大肠杆菌, 是采取发病鸡肝脏、脾脏等病料分离培养所得。选取麦康凯琼脂上长出的红色菌落,做药敏试验。

1.1.3 培养基

普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、普通肉汤培养基等均为自制。葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖和枸橼酸盐等为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 药敏纸片

庆大霉素(10 g/ 片,批号: 1702181);环丙沙星(5 g/ 片,批号:1702171);链霉素(15 g/ 片, 批号:1703101);青霉素 (10 g/ 片,批号:1701071);磺胺甲嗯唑 (20 g/ 片,批号:1702181);罗红霉素(15 g/ 片,批号:170902); 阿莫西林(10 g/ 片,批号: 16010105),以上药敏纸片均由河南省生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养

在无菌环境下操作,采取发病鸡的肝脏、脾脏以及十二 指肠作为病料,接种在普通琼脂平板及普通肉汤培养基上, 37℃下培养 20 h,抹片,革兰染色镜检。挑取表面光滑、边缘整齐、灰白色半透明的单个小菌落画线接种于麦康凯琼脂平板,于 37℃恒温进一步培养, 24 h 后观察病原菌的生长及菌落特征。

1.2.2 形态学观察

取在麦康凯琼脂平板上培养的新鲜菌落,抹片进行革兰染色镜检。观察并记录菌体形态以及染色特征。

1.2.3 生化试验

糖发酵实验:取经 2~3 天培养后的培养基观察,凡是显示黄色的表示此糖被酵解(以 + 表示); 不变色者表示该菌不发生酵解(以 – 表示)。

MR 实验:取一支经 2~3 天培养的葡萄糖蛋白胨水培养管,加入MR 试剂 5 滴左右,呈红色者为阳性(+),呈黄色者为阴性反应(-)。

V-P 实验:再取 一 支经 2~3 天培养的葡萄糖蛋白胨水培养管,先加 V-P 试剂甲液 (6%甲萘酚酒精溶液)3 mL, 再加 V-P 试剂乙液(40%KOH 溶液)1mL,充分摇匀数分钟后呈红色者为阳性反应;不出现红色者放在 37℃继续培养 1~ 2 h,仍不变色者为阴性。

吲哚实验:取蛋白胨水培养管先加入少量乙醚,塞紧棉塞摇匀,静置片刻加入吲哚 2~3 滴,凡在乙醚中出现玫瑰红者为阳性反应,不变色者为阴性。

枸橼酸盐利用实验 :经 2~3 天培养的枸橼酸盐琼脂管上有细菌生长,变为天蓝色 者表示该菌能利用枸橼酸盐, 否则为阴性。

H2S 实验:观察经 2~3 天培养的醋酸铅琼脂管,穿刺线或周围有黑色沉淀的为 H2S 阳性反应,否则为阴性。

运动力:半固体琼脂培养基部分或全部变混浊表示细菌有鞭毛能运动,否则无鞭毛。

1.2.4 血清型鉴定

按照大肠杆菌 O 抗原鉴定使用说明书制作抗原液,并进行细菌的血清型鉴定。

1.2.5 药敏试验

无菌环境下操作,取新鲜的大肠杆菌纯培养物,按常规手法均匀涂抹于营养琼脂平板上,再用无菌镊子取各抗生素药将药敏纸片平均分布在培养基表面上,将平板倒置,于 37℃恒温培养,18 h 后测量抑菌圈直径。

2、结果与分析

2.1 形态学观察

显微镜检查可见到细菌为革兰染色阴性,两端钝圆,长为 1.4~3.5 gm 的短小杆菌,多单独散在排列,偶有 2~4 个连在一起,无芽孢。

2.2 鉴别培养

大肠杆菌在麦康凯琼脂上呈红色、圆形微凸起、边缘整 齐、表面光滑湿润、直径为 1.5~2.5 mm的菌落;在普通琼脂斜面上的菌落为灰白色;在普通肉汤中均匀混浊,管底有灰白色沉淀,并有粪臭味。

2.3 生化试验

生化试验结果见表 1。

结果显示在病料中分离的细菌能够分解葡萄糖、蔗糖、乳 糖、甘露醇和麦芽糖,并且能够产酸产气。而且该细菌 M.R 试 验呈阳性,V-P 试验阴性,能够产生吲哚,不能利用枸橼酸盐, 不能产生硫化氢。初步断定所分离的细菌为大肠杆菌。

2.4 血清型鉴定

大肠杆菌 O 抗原鉴定出的血清型为 O78

2.5 药敏试验

分离出的病菌对抗生素敏感度结果见表 2。由表 2 可以看出,分离菌对庆大霉素、环丙沙星最敏感,而对阿莫西林、青霉素和磺胺嘧啶钠等药物不敏感。

3、讨论

(1)本次试验所采取的病株均在有明显症状的病鸡身上采集,通过分离鉴定,可以确定其为大肠杆菌。

(2)药敏试验结果发现, 该大肠杆菌对青霉素、磺胺嘧啶钠和阿莫西林存在耐药性, 这是由于现在养殖业普遍盲目滥用各种药物,甚至有人把抗生素作为饲料添加剂来使用, 造成严重的耐药性。因此,鸡场应合理选用药物,在进行治疗时应当首先进行药敏试验,采取敏感性较强的药物进行治疗,尽量联合交叉用药,不要长期使用同一抗生素,以防止耐药菌株的出现。同时由于现在养殖业规模逐渐增大,养殖量较大,鸡苗品种来源比较广泛, 致使大肠杆菌血清型繁多,因此疫苗尽量选用针对性强的效果最好。

(3)临床上鸡大肠杆菌病的发生与环境卫生、气候、饲料营养、饲养管理、机体抵抗力和免疫力等密切相关。所以临床防治本病,应该加强种源管理, 坚持清洁卫生,加强饲养管理, 控制饲养条件。从饲料卫生、饲养管理、疫苗注射及合理选择药物等方面做好预防工作,采取预防为主,防治结合的措施, 较大限度降低疾病的发生。并且致病性大肠杆菌病也是一类严重的人畜共患病,大肠杆菌可以通过菌毛将耐药质粒或耐药基因传递给其他大肠杆菌, 特别是食源性动物耐药菌通过各种途径将耐药基因或质粒传递给人类致病菌,给人类健康造成严重的危害。所以,应认真做好防治工作。

4、结论

试验结果表明,分离出的细菌符合大肠杆菌的特征,致病性大肠杆菌优势血清型为 O78,且对环丙沙星、庆大霉素高度敏感,对链霉素中敏,对磺胺嘧啶钠、青霉素和阿莫西林表现为耐药。

作者:刘亚慧(河南省安阳县农业畜牧局,河南安阳 455100)

责任编辑:徐成刚

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