禽白血病研究进展

禽白血病(Avianleucosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)和禽肉瘤病毒(Aviansarcomavirus,ASV)群(或称为“禽白血病 /肉瘤病毒群”,现在大都称为“禽白血病病毒”)中的病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分增生为主的肿瘤性传染病的统称

禽白血病(Avian leucosis)[4] 是由反转录病毒科(Retroviridae)禽白血病 / 肉瘤病毒群病毒(Avian leukosis/sarcoma virus)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。本病在世界各地均有发生,是危害养禽业的主要疾病之一。有关本病危害的研究报道可追溯到 19 世纪末期,尽管养鸡者已意识到禽白血病的危害, 但由于这种病流行所造成的直接经济损失相对较小,所以常被人们忽视。直到 1997 和 1998 年,J 亚群禽白血病在世界范围内暴发,除澳大利亚和新西兰外,世界各国都不同程度地遭受了 J 型禽白血病的袭击,给养禽业造成了巨大的经济损失 [5] ,禽白血病才受到养禽业的高度重视,同时也成为学术界关注和研究的热点。禽白血病导致的经济损失主要有两个方面 [6] 。一是产生肿瘤,导致鸡的死亡。二是产生非肿瘤综合征,表现为生产指标发生变化,如性成熟推迟、母鸡产蛋率下降、蛋重下降、受精率下降和孵化率下降,由此严重影响养鸡生产。此外,禽白血病一旦感染后,可引起鸡群的免疫抑制,会继发诸如马立克氏病、传染性法氏囊病、鸡传染性贫血等免疫抑制病,从而造成更严重的损失。

但至今,人类对禽白血病既没有疫苗可以利用,也没有有效的药物可以治疗,控制禽白血病的主要方法是通过病原检测,淘汰阳性鸡,净化种群。目前,国际上检测禽白血病病毒抗原常用的检测方法是 ELISA 法 [8] ,它具有敏感性高、简便快捷及适用于大规模检测的特点。1979年以来,禽白血病的 ELISA 诊断试剂盒在国外已实现商品化,但至今 ELISA 诊断试剂盒在我国初步实现商品化。尤其近年来,我国建立了数家 SPF 鸡场,今后还会不断增加,对 SPF 鸡群AL/SV-gs 抗原检查目前主要依靠进口试剂盒,不仅价格昂贵而且不方便。因此,研制较先进的国产试剂盒是我们当前急需要解决的问题。

1、病原学

1.1 病毒的分类与命名

禽白血病病毒(ALV),曾称为禽白血病增生病病毒、鸡淋巴细胞性白血病病毒或禽白血病综合征病毒 [9] ,是以主要引起禽各种造血细胞肿瘤性增生为特征的一类反转录病毒群,其中,一些毒株最先分离于所谓的 Rous 肉瘤病毒(RSV),所以,称之为 Rous 相关病毒(RAV)。从ALV 的命名来看,禽白血病病毒是反转录病毒科中毒株较丰富的一大群动物 RNA 病毒。根据国际病毒分类委员会(ICTV)第 9 次分类报告 2012 年公布版本,所有登录的 ALV病毒株属于反录病毒科(Retroviride)、正反录病毒亚科 (Orthoretrovirinae)、甲型反录病毒属(Alpharetrovirus)[10]

1.2 病毒的形态结构

禽白血病病毒是具有脂囊膜的反转录RNA 病毒,粒子近似球形 [11] ,整个病毒粒子的直径平均 90nm(80~130nm),衣壳呈 20 面体对称 [12] 。在某些干燥情况下,病毒粒子容易变形。

ALV 病毒粒子可以分为 3 层:外层是源于宿主细胞膜的类脂质囊膜,表面分布有特征性的放射状突起即纤突,直径约 8nm;中层是病毒的内膜,为 20 面体衣壳,直径约为 60nm;最内层是致密的核心,直径为 35~45nm,核心结构由二倍体 RNA 和核衣壳、反转录酶、整合酶、蛋白酶组成 [13] 。中层和最内层构成内部结构,直径为35~45nm [14]

病毒全部化学组成包括:脂类、蛋白质、核酸和糖类。蛋白质占病毒粒子的 60%~65%,主要是一些蛋白质和酶类;脂类占 30%~35%,主要存在于囊膜中;核酸主要是 RNA,约占 2.2%;病毒的糖类主要在蛋白的糖基化位点上。

1.3 病毒的理化性质与抵抗力

ALV 在蔗糖中的浮力密度为 1.15~1.17g/cm 3 。ALV 对外界环境的抵抗力很弱,在外界环境存活时间比较短 [14] 。ALV 在高温下快速失活,在 pH 值为 4.5~9时,能保持稳定,超出这一范围,灭活率显著升高;对热、脂溶性、去污剂和甲醛敏感,蛋白酶能够去除病毒粒子表面的部分糖蛋白,对紫外线的抵抗力相当强。

1.4 禽白血病病毒核酸、基因组结构及蛋白质

ALV 的基因组是单股、正链、线性 RNA 的二聚体,单体长为 7~11kb,RNA 约占病毒干重的 2%。病毒粒子中的 RNA 不具有感染性,两分子的 RNA 在各自的 5 端通过氢键相连接。一分子的基因组 RNA 还与一分子特异的来源于宿主的 tRNA 相连,成为病毒 RNA 反转录过程中生成 DNA 的引物。

反转录病毒基因组 RNA 单体的结构与真核细胞的 mRNA 相似,5 端为甲基化的帽子结构,3 端为 ploy(A)。RNA 基因组的两端为非编码区,中间部分为编码区,编码区有 4 个结构基因,从 5 到 3 依次为 gag/pro—pol—env。全基因型的白细胞增生病病毒,除有上述基因外,还有多种调节基因如 Vif、Vpr、tat、rev 和 nef 等,RSV 则在 env 基因下游有致瘤基因 SIC。缺陷型病毒基因组缺失部分或大部分结构基因:均缺失 env 基因,大多数缺失全部 pol 基因,gag基因部分缺失或不缺失,结构基因的缺失处由同源性较低、名称各异的致瘤基因所取代。

ALV 粒子的核心蛋白(Gag)有 4 种,即基质蛋白(MA)p19、p10 蛋白、衣壳蛋白(CA)p27 和核衣壳蛋白(NC)pl4,其中 p27 为主要的群特异性抗原;酶蛋白有蛋白酶(Pro)p15,反转录酶(RT)p68 和整合酶(IN)p32。病毒囊膜含有 2 种由囊膜基因编码的糖蛋白:gp85 组成囊膜表面突起的球状结构,且决定禽白血病的亚群特异性;gp37 贯穿于囊膜。这 2 种囊膜蛋白连接形成二聚体,即病毒糖蛋白(VGP)。

2、流行病学

2.1 分布

目前,禽白血病已经呈世界性分布,欧洲、亚洲、非洲、南美洲、北美洲的一些国家和地区均有禽白血病的发生。

2.2 传染源、易感动物和非常规宿主

病鸡、带毒鸡和感染的种蛋是本病的传染源。

ALV 的易感动物主要是禽类,在禽类中,ALV 容易感染鸡。到目前为止,除了雉鸡、鹧鸪和鹌鹑外,ALV 在水禽(鸭和鹅)等其他禽类中的感染或发病的报道较罕见。

赵振华 [15] 报道,火鸡和其他禽类也可感染ALV。Payne [16] 报道,竹鸡等鸟禽类也可感染。

2.3 传播途径与方式

ALV 的传播方式包括垂直传播和水平传播 [18]

崔治中 [17] 指出,免疫时不更换针头是 ALV传播的主要途径。被 ALV 污染的弱毒疫苗也是重要的传播途径。

水平传播通过 ALV 污染的分泌物、排泄物和设备如注射针头等,感染其他细胞、器官及鸡体,如小鸡孵化或鸡在交配时通过密切接触而感染 [19]

垂直传播主要通过种鸡 -> 种蛋 -> 孵化鸡胚 -> 雏鸡这一途径从上一代鸡群感染下一代鸡群,并且逐代放大 [20] ,垂直传播由于在世代间持续不断,因此,流行病学意义较重要。ALV经垂直方式感染鸡只后,在较长的时间内,几乎不出现抗体反应,而表现为持续的耐受性病毒血症,而且在泄殖腔也持续性排毒 [21] 。垂直传播的鸡容易患肿瘤,这些鸡体内带有高浓度的ALV,是水平传播的主要来源 [22]

2.4 流行特点

感染的雏鸡不一定全部发病,感染愈早发病率愈高。免疫耐受鸡又称保毒鸡,其发病死亡率比其他有抗体鸡群要高。ALV 在雏鸡中广泛感染传播,如宿主鸡对病毒存在遗传抵抗性,即使感染,发病也较少,感染鸡成为病毒携带者和传播者。可见感染了 ALV 的鸡不一定发病,没有发病的鸡不等于没有感染 ALV。鸡群发病死亡常在鸡性成熟开产之后,剖检可见多种器官有肿瘤。能引起免疫抑制的疾病如马立克氏病、鸡传染性贫血等均能增加 ALV 传播。

3、诊断

由于 ALV 囊膜基因的不断变异引起抗原的变动,同时外源性 ALV 和内源性病毒的相互作用导致 ALV 不断发生改变,使得 ALV 难以根除。目前,各国控制该病的主要手段是对鸡进行 ALV 的检测,淘汰带毒的种鸡,通过不断的净化达到纯洁种群的目的。国内外相继建立了多种检测 ALV 的方法。

3.1 国内主要检测禽白血病病毒的方法

2012 年贠炳岭等 [23] 用 p27 蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体建立了检测 ALV 的双抗体夹心 ELSIA,为 ALV 的早期诊断及种鸡场的净化提供了有效工具。2011 年刘绍琼等 [24] 用间接免疫荧光技术检测 817 肉瘤组织中的 ALV-A 和ALV-J,具有简单、快速的特点。2005 年徐缤蕊等 [25] 以 ALV-J 特异性单克隆抗体用于免疫组织化学法检测感染蛋鸡组织中的 ALV-J gp85 蛋白的表达,证实了商品蛋鸡中存在 ALV-J 感染。2012 年梁有志等[26]用胶体金标记针对ALVp27 蛋白的单克隆抗体制备了检测 ALV 抗原的快速检测试纸条。2001 年,刘公平等 [27] 比较ALV-A、B、C、D 和 E 亚群全基因组序列,针对gp85 基因区上下游的保守序列设计了一对引物,建立了 PCR/RFLP,用于诊断禽白血病和鉴别不同的 ALV 毒株的感染。

3.2 国外主要检测禽白血病病毒的方法

1968 年 PayneLN 等建立的检测禽白血病群特异性抗原的间接补体结合试验,曾为禽白血病的检测做出了重要贡献。1979 年,Smith 用兔抗禽白血病衣壳蛋白 p27 的 IgG 建立了检测ALV 抗原的双抗夹心 ELISA 法,试剂盒实现了商品化。2002 年 Zavala G 等 [28] 建立了一种 PCR方法,可以从鸡羽髓中检测 ALV-J 的前病毒DNA。2007 年,Silva [29] 等选取 pol 基因下游片段为上游引物,以 gp85 基因下游片段为下游引物,设计了一系列引物可鉴别禽白血病病毒和区分不同亚群。

4、防制

到目前为止,对 ALV 感染的发病鸡未发现有效的治疗措施。当发生 ALV 感染疫情时,应做好如下工作。

4.1 立即上报

当鸡群发生禽白血病时,要立即向上级畜牧兽医主管部门报告疫情。在上级指派处理人员到来之前,要采取合理措施,防止疫情扩散;同时,禁止乱扔病死禽只;对发病鸡群不得随意销售。

4.2 做好隔离、封锁

按照动物防疫法的要求做好鸡群隔离和鸡场的封锁措施。

4.3 搞好环境卫生

发现病鸡及时进行无害化处理,按时清理粪便。及时消毒,鸡舍及其用具在进鸡场前彻底清洗消毒。

4.4 加强饲养管理

饲养管理良好的鸡群, 机体免疫机能强,即使是感染了 ALV 也可以不发病。因此,饲养管理较重要。

4.5 治疗

有人尝试用中药方剂治疗禽白血病。刘再池等 [30] 曾对性成熟时期的患淋巴性白血病病鸡群用自拟补益方剂进行了探索性治疗试验,疗效明显,但尚存在许多不足。

RNA 干扰(RNAinterference,RNAi)技术是一种新的生物技术,在基因治疗领域发挥重要作用。

5、结语

ALV 作为反转录病毒中的一员,可引起禽类的多种肿瘤性疾病,可作为研究癌症的重要模型,尤其对无致癌基因病毒致癌机制的研究,将为人类控制和预防癌症提供借鉴。早在 1902年,人类第一次发现病毒可以引起肿瘤,就是在Temin 研究鸡 RSV 时观察到的 [31] 。ALV 与其他反转录病毒一样, 具有独特的基因组结构和生命周期, 这决定了它可以作为细胞间基因转移的有效载体, 在分子生物学研究和基因治疗中发挥重要作用。不同遗传背景的鸡对 ALV 的易感性不同,鸡对 ALV 感染的遗传抗性由细胞表面是否存在与 ALV 囊膜蛋白 gp85 结合的受体决定。而某些带有内源性 ALV 的鸡对外源性病毒的感染具有遗传抵抗力。因此, 在未来选育ALV 抗性鸡是防制禽白血病的主要手段之一。而另一方面, 在禽白血病的研究中,SPF 鸡又是必备的实验材料,培育出针对各亚群 ALV 敏感的 SPF 鸡群,在科学研究中具有一定的价值。在国外, 已经培育出针对各亚群 ALV 敏感的 SPF近交品系鸡群。在我国,对 SPF 鸡胚细胞遗传抵抗力的研究工作还有待于开展, 以便找到适合各种亚群病毒生长的实验材料, 使我国对 ALV的研究更科学化、准确化。总之,随着我国养禽业的飞速发展,SPF 鸡群的逐步建立以及科研、生产和检疫的需要,目前,建立一种高效、敏感、特异的 ALV 的检测方法,有重要意义。

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作者:李浩然(华南农业大学动物科学学院,广州 510642)

责任编辑:曹伟胜

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