H7N9 亚型流感病毒对 4 种消毒剂及紫外线的敏感性研究

为了研究 H7N9 亚型流感病毒对二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘、氢氧化钠等常用消毒剂及紫外线的敏感性,通过模拟现场消毒场景,将不同种类和不同浓度的消毒剂分别与 H7N9 亚型流感病毒充分作用,评价病毒对消毒剂的敏感性;评价在紫外照射强度 90μW/cm 2 条件下病毒的存活情况。结果显示:H7N9 亚型流感病毒在二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘、氢氧化钠有效浓度分别为 1:5 000、0.1%、0.1%、1%的条件下可完全被杀灭;在紫外照射强度 90μW/cm 2 条件下 15min 可完全被杀灭,表明 H7N9 亚型流感病毒对 4 种消毒剂以及紫外线均具有较强的敏感性。本研究还进行活禽市场的现场验证,与实验室的研究结果一致。

自 2013 年 3 月在我国上海和安徽首次发现人感染 H7N9 亚型流感病毒感染病例以来,H7N9 流感至今已经历了第五波疫情,根据世界卫生组织(WHO)的报告,绝大多数病例与活禽、宰杀的家禽或活禽市场有过接触。2016 年12 月至 2017 年 2 月,人感染 H7N9 流感病例数急剧上升,2017 年 2 月 19 日国家疾病控制中心确认发现 H7N9 病毒变异株,变异株 HA 裂解位点处发生插入性突变,呈现对家禽的高致病力分子特征 [1] 。这对我国 H7N9 流感的防控提出了巨大挑战,为了防止人感染 H7N9 流感病毒病例的不断蔓延,保护好养禽业,做好活禽市场及可能污染区域的消毒工作是切断其传播途径的重要措施。但消毒措施一直缺少可靠的消毒技术规范,尚未有针对 H7N9 流感病毒的消毒标准。为了探究 H7N9 流感病毒对不同消毒剂及消毒方式的敏感性,本研究在实验室条件下模拟现场消毒,并选择有代表性的活禽市场进行现场验证,以期为 H7N9 流感病毒消毒标准的建立提供参考,为活禽市场干预措施的制定提供理论依据和技术数据。

1、材料与方法

1.1 试验毒株

毒株名称 A/Chicken/Guangdong/32/2013(H7N9),由华南农业大学兽医学院农业部人畜共患病重点实验室分离鉴定并保存。毒株的EID 50 为 10 -7.167 /0.2mL。

1.2 消毒剂及相应中和剂:

二氯异氰尿酸钠:由湖南某生化公司生产,批准文号:兽药字(2011)180086051。规格含有20%有效氯,使用说明用量 1:200~1:2 000 稀释。中和剂:等量的硫代硫酸钠。

复合酚:由广东某生物有限公司生产,批准文号:兽药字(2011)190132097,许可证号:(2014)兽药生产证字 19013 号。规格含酚 41%~49%,醋酸 22%~26%,使用说明用量 0.3%~1.0%。中和剂:等量的吐温 80。

聚维酮碘:由湖南某生化有限公司生产,批准文号:兽药字(2012)180081575。规格含聚维酮碘 5%,使用说明用量 0.1%~5.0%。中和剂:等量的硫代硫酸钠。

氢氧化钠:分析纯氢氧化钠,CAS:1310-73-2,上海某公司生产。实验室现用现配,建议使用浓度为 5%。中和剂:等量的盐酸。

1.3 其他材料及主要器材

1.3.1 其他材料

有机干扰物:30 g/L 小牛血清白蛋白溶液(参考《兽用消毒剂鉴定技术规范》[2] )。

标准硬水:称量无水氯化钙 0.304g 和带结晶水的氯化镁 0.139g 于 1 000mL 的容量瓶中,用蒸馏水溶解稀释定容至刻度(参考《消毒技术规范(2008 年版)》[3] )。

鸡胚:9~11 日龄普通鸡胚,由新兴大华农禽蛋有限公司供应。

1.3.2 主要仪器及试剂

AirstresmⅠ级 A2 型生物安全柜,ABI7500荧光 PCR 仪,Ependorf 高速冷冻离心机。

H7N9 荧光 PCR 检测试剂盒,购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 消毒剂对鸡胚的毒性

标准硬水稀释,配制二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘、氢氧化钠浓度分别为 1:200、5%、5%、5%,接种 9~11日龄鸡胚尿囊腔,每枚鸡胚接种 0.2mL,重复 3枚鸡胚,置于 37 ℃恒温箱内孵化 48 h,24 h 内死亡胚为非特异性死亡,48 h 后收获尿囊液,测定血凝(HA)。

二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘和氢氧化钠的配制浓度与上同,分别按照 1:9 混合加入相应量的中和剂硫代硫酸钠、吐温 80、硫代硫酸钠、盐酸,充分反应 10 min。取中和产物接种鸡胚,测定血凝。

1.4.2 H7N9 流感病毒对 4 种消毒剂的敏感性

共 5 组,4 个实验组分别为二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘、氢氧化钠 4 种消毒剂的不同稀释浓度,第 5 组为空白对照组,加等量的标准硬水。4 种消毒剂稀释浓度见表 1。

病毒液稀释至 10 5 EID 50 ,按照 30 g/L 的剂量加入小牛血清白蛋白溶液,制备好的病毒液分装,-80℃保存备用。

消毒剂组:取制备好的病毒液 0.5 mL,分别加入不同浓度的消毒剂 4.5 mL,充分混匀,置于室温(20~25℃)反应 15 min,吸取反应液 1mL,加入 9 mL 相应浓度中和剂,作用 10 min 之后,每一管混合液接种鸡胚 0.2 mL,重复 3 枚。孵化48 h 后,测定血凝 ( HA)。4 个消毒剂组的方法相同。

对照组:取制备好的病毒液 0.5 mL,加入4.5 mL 的标准硬水,充分混匀,置于室温(20~25℃)反应 15 min,吸取反应液 1 mL,加入 9mL中和剂,作用 10 min 之后,每一管混合液接种鸡胚 0.2 mL,重复 3 枚。孵化 48 h 后,测定血凝( HA)。

结果记录:病毒阳性率 = 血凝 ( HA) 阳性数 /3×100%

病毒杀灭率 =(对照组病毒阳性率 – 消毒剂组病毒阳性率)/ 对照组病毒阳性率×100%

消毒剂对病毒的杀灭率达到 99.9%以上说明病毒对消毒剂敏感。

1.4.3 H7N9 流感病毒对紫外线照射的敏感性

将 2.2 中制备好的病毒液 10 mL 置于面积为 12.56cm 2 的圆形玻璃平皿中,平皿开盖置于生物安全柜中用紫外线照射,照射强度为90μW/cm 2 ,分别照射 5 min、10 min、15 min、20min 和 30 min,取照射后病毒液分别接种鸡胚,进行血凝 ( HA) 效价的测定。设一组对照,同等条件下平皿盖上盖,阻挡紫外线照射,其他步骤与上同。

1.4.4 活禽交易市场的验证

在广东某市选择有代表性的 4 个活禽交易市场 A、B、C 和 D 分别进行现场消毒效果评价实验。A、B 和 C 市场商品鸡空栏后进行清理消毒。D 市场未售完商品鸡在市场过夜,带鸡消毒。采用先冲洗,再消毒,再冲水的方法进行处理。消毒剂根据实验室模拟实验中获得病毒敏感的最低浓度进行配制,即:二氯异氰尿酸钠 1:5 000、复合酚 0.1%、聚维酮碘 0.1%。

消毒前及消毒后三天,在市场采集环境样品,采用荧光定量 PCR 方法进行 H7N9 流感病毒检测。

2、结果

2.1 消毒剂以及中和产物对鸡胚的毒性测定

1:200 二氯异氰尿酸钠、5%复合酚、5%聚维酮碘、5%氢氧化钠以及消毒剂与相应中和剂中和反应产物不凝集红细胞,且对鸡胚不致死,眼观无病理变化。排除消毒剂本身以及中和产物对红细胞的血凝作用以及对鸡胚的毒性作用的影响。

2.2 H7N9 流感病毒对 4 种消毒剂的敏感性

消毒剂对病毒的杀灭率达到 99.9%以上,说明病毒对消毒剂敏感。消毒剂对病毒的最低有效浓度是指病毒对消毒剂敏感的最低浓度。二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘和氢氧化钠4 种消毒剂杀灭 H7N9 病毒的结果见表 2。结果表明:在实验室条件下,二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘及氢氧化钠的最低有效浓度分别为 1:5 000、0.1%、0.1%和 1%。

2.3 H7N9 流感病毒对紫外照射敏感性

紫外照射对病毒的杀灭率达到 99.9%以上说明敏感。结果见表 3。 结果表明:在照射强度为 90μW/cm 2 时,紫外照射杀灭 H7N9 流感病毒的最短有效时间为 15 min。

2.4 活禽交易市场的验证

在广东省的 A、B、C 和 D 等 4 个活禽交易市场进行验证。消毒前后的病毒阳性率对比结果见表 4。

3、讨论

当环境中存在畜禽的粪便及其他污染物等有机物时,有机物中会储藏大量的病原微生物消耗消毒剂的有效成分,降低消毒剂的消毒效果。为了尽可能接近现场情景,在实验室模拟现场消毒过程中加入了有机干扰物牛血清白蛋白 [2] ,同时有机物干扰物的浓度对各种消毒剂的影响也不同 [3] 。相关文献证实随着牛血清白蛋白浓度的增加,消毒剂对病毒的灭活效果干扰越大 [4] ,加入 0.3%牛血清白蛋白比加入 3%牛血清白蛋白的同样含氯消毒剂消毒效果要好。因此,本研究中选用 30 g/L 的牛血清白蛋白作为干扰物。参考《消毒技术规范》(2008 年版),宜选用标准硬水稀释病毒 [2] 。硬水含有较多的钙离子、镁离子等,而自来水中也含有钙离子、镁离子,而且不同地区自来水的硬度也不同。所以用标准硬水稀释更接近实际使用情况。

按照国内消毒剂检测规定,用杀灭率表示消毒效果,消毒剂的杀灭率达到 99.9%即认为具理想的消毒效果 [5] ,即表示病毒对该浓度的消毒剂敏感。H7N9 流感病毒对 4 种消毒剂的敏感性研究数据表明,二氯异氰尿酸钠、复合酚、聚维酮碘和氢氧化钠最低有效浓度分别为 1:5 000、0.1%、0.1%和 1%。同时,消毒剂的使用说明推荐使用的浓度范围是二氯异氰尿酸钠 1:200~1:2 000、复合酚 0.3%~1.0%、聚维酮碘0.1%~5.0%。结合实验结果病毒对消毒剂敏感的最低浓度在使用浓度范围中甚至低于使用浓度,说明在市场中消毒用常用消毒剂的使用浓度即可以达到对 H7N9 流感病毒的理想杀灭效果。

活禽交易市场被认为是流感病毒的混合场所,且污染 H7N9 流感病毒的风险较高。目前的研究也认为,活禽交易市场是传播禽流感病毒的温床,活禽市场也是人感染 H7N9 亚型病毒的重要来源地 [6,7] ,是人感染 H5N1、H7N9 等亚型流感病毒的高风险区域 [8,9,10] 。因此合理使用消毒剂和严格执行消毒措施对于控制禽流感病毒的传播至关重要。本研究中的 4 个市场均严格执行消毒制度,采用冲洗 – 消毒 – 冲洗的方法,但消毒效果却差异显著。究其原因,A、B 和 C市场严格执行了空栏措施,即活鸡全部清空后再进行消毒,而 D 市场未清空活禽,市场实施带鸡消毒。四个市场均严格执行消毒制度,均采用冲洗 – 消毒 – 冲洗的方法。分析结果,在严格执行消毒前,四个市场均能检测到 H7N9 流感病毒。分别使用不同的消毒药严格消毒后,A、B、C 三个市场均未检测到 H7N9 流感病毒,证明消毒剂的效果良好,而 D 市场还可以检测到病毒,甚至 H7N9 流感病毒的阳性率有所上升。该结果说明,仅仅依赖消毒效果明显的消毒剂和消毒措施是远远不够的,还应有其他配套的管理措施。特别是,家禽进入市场后如果不能及时售出,随着停留时间的延长(超过 24小时),禽流感病毒检测的阳性率就会明显提高 [10,11] 。据此广东省于 2014 年出台了《广东省家禽经营管理办法》[12] ,规定活禽交易市场须实行一日一清扫、一周一消毒、一月一休市制度,以及活禽零售市场每日零存栏制度,即“1110”制度。比如,每月休市能够迅速减少禽流感病毒污染率 [13] 。相关部门也应该针对活禽市场中的各个关键环节开展 H7N9 病毒感染风险的评估,从而为政府出台有效的干预措施提供科学依据。

为阻止 H7N9 流感病毒在环境中蔓延,对污染环境的可靠消毒是阻断传播途径的有效方法。然而,许多因素直接或间接影响消毒剂杀灭病毒的效果,造成消毒效果不理想。本研究在实验室条件下尽量真实模拟现场情况,进行H7N9 病毒对常用消毒剂和消毒方法的敏感性研究,同时在活禽交易市场进行验证,对影响消毒效果的因素进行对比,为活禽市场干预措施的制定提供了宝贵数据,同时也为进一步开展相关风险分析研究提供了基础。

4、结论

H7N9 亚型流感病毒在 4 种消毒剂的常规使用浓度下是敏感的,在紫外线照射 15 min 即可达到理想杀灭效果。在现阶段,对 H7N9 亚型流感病毒的防控,尤其是活禽交易市场中H7N9 亚型流感病毒的控制,仅仅依赖消毒效果明显的消毒剂和消毒措施是不够的,市场的综合管理措施也非常重要。

参考文献

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[10] 钟锦辉,彭聪,彭南秀,等. 基于禽流感病毒检测的活禽零售市场“零存栏”效果评估. 中国动物检疫. 2016,33(8):13-16.

[11] 贾伟新,廖明. 从活禽交易的干预效果看我国禽流感的流行与防控 [J]. 中国家禽,2015,37(25):1-3.

[12] 广东省人民政府. 广东省家禽经营管理办法 [EB/OL].(2014-12-15 [2016-05-30].http://zwgk. gd. gov. cn/006939748/201412/ t20141215_559975.html.

[13] 彭聪,彭南秀,段晓冬,等. 广州市活禽交易市场休市效果评估队列研究. 中国动物检疫.2016,33(8):3-7.

作者:邢利1# ,钟亮宁 2 ,殷三鸿 2 ,刘兆洁 1 ,徐振娜2 ,贾伟新 1 ,廖明1*(1.华南农业大学兽医学院,人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室,广州 510642;2.广东省东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞 523086)

基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-42-G09);广东省科技计划项目 (20140224、2013B020224004);广东省农业厅专项[粤财农(2014)380 号];东莞市科技计划项目 (2014108101041)和科技基础性工作专项(2012FY111000)。

# 作者简介:邢 利 (1990-),女,山西忻州人,硕士,主要从事畜禽传染病的研究。Email: vet_2015xl@stu.scau.edu.cn.

* 通讯作者: 廖明,教授,E-mail:mliao@scau.edu.cn. Tel:+86-020-85280240。

责任编辑:曹伟胜

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