鸽雌雄鉴别快速检测技术研究进展

本文对鸽雌雄鉴别快速检测技术的研究进展进行了综述,主要包括 PCR 技术、RT-PCR 方法、荧光定量 RT-PCR 及环介导等温扩增技术等多种方法。通过比较这些技术,对鸽子的快速性别鉴定研究作一概述,为建立快速、简便、经济的鸽子性别鉴定方法提供参考。

性别鉴定在禽类生产中占有重要地位,性别的早期鉴定将有助于节约禽类饲养成本,提高养殖效率。翻肛鉴别法是目前在家禽生产中运用较广泛的方法,但是初生鸽体型小,难以在早期进行性别鉴定,生产上一般到 5 月龄左右才能用此方法鉴别,但鉴别的结果正确率低,耗时耗力,对鸽子应激大 [1] 。另外,鸽子属于典型的“一夫一妻制”,需要准确且及早地鉴定其性别,否则不利于产业化饲养管理与种鸽选育。随着生物技术的不断发展,研究出了一系列鸽子性别鉴定的分子生物学方法。本文将对鸽雌雄鉴别检测技术研究进行综述,旨在为快速、简便、经济的鸽子性别鉴定提供思路。

1、PCR 技术

染色质解螺旋蛋白 DNA 结合蛋白 1 基因(chromodomain helicase DNA binding protein 1,CHD1) 与 Z 染色体或 W 染色体连锁,它在鸽子等非平胸鸟类的两条性染色体上内含子的长度不同 [2] 。设计特异的引物,利用 PCR 扩增该基因,再根据扩增的片段大小和数量,从而判断鸽子性别。目前应用比较广泛的引物对主要有P2/P8、2550F/2718R、CHD1Z/ CHD1W 等,其中前两种是鸟类性别鉴定通用型引物,已经在多个研究中被证实有效,而 CHD1Z/ CHD1W 则是根据鸽子的 DNA 序列设计的引物,其具有特异性更强、扩增效果更好的特点[3-5] 。CHD1Z/CHD1W 引物序列为:F:5′ -TGCAGAAG-CAATATTACAAGT-3′ ;R:5′ -AATTCAT-TATCATCTGGTGG-3′。

为了解决本方法中 DNA 来源的问题,研究人员比较了采血以及采集羽毛对性别鉴定的影响,结果发现只需要 1 根羽毛就可以提取到足够多次用于性别鉴定的 DNA 模板量。这样可以省去抗凝剂等的消耗,且对动物应激较小。而后只需要简单的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像就可以获得最终的性别鉴定结果,以 CHD1Z/CHD1W 为例,雌鸽会产生 2 条条带,而雄鸽则只有 1 条条带。批量的样品经过上述步骤处理,样品的处理时间及成本消耗得到了较大的降低。

2、RT-PCR 方法

与 PCR 技术相比,RT-PCR 在鸽子性别鉴定上的研究应用鲜见报道,但是其鉴别效果的准确性已经在其他动物上得到了验证。非重复基因组 DNA 片段 (EE 0.6) 序列是从鸡的 W 染色体克隆而来的一段长度为 0.6 kb 的片段,简称 Wpkci (W-linked protein kinase C inhibitor) 基因,其在鸟类的 W 染色体上非常保守,从 mR-NA 水平可以准确鉴定 [6] 。乔爱君等根据鹌鹑的Wpkci 基因编码区设计引物,对于鸡与鹌鹑杂交早期胚胎扩增,成功鉴定了早期杂交胚胎的性别 [7] 。其原理是提取总 RNA 后进行消化获得较纯的 RNA,经过 RT-PCR 之后对目的基因进行扩增后经琼脂糖凝胶电泳,出现 2 条特异条带的杂交种胚胎即为雌性,而没有条带的即为雄性。郑炜等将该技术与使用 2550F/2718R 的普通 PCR 进行比较后发现,两者的鉴定性别结果一致 [8] 。但是该方法对样品质量要求较高,且操作程序较为复杂,相对于 DNA 的 PCR 检测,费时费工,成本较高。

3、荧光定量 RT-PCR 技术

实时荧光定量 PCR 是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,是在 PCR 技术基础之上发展起来的一种技术。Huang 等利用该技术对3 个品种的鸽子进行了性别鉴定,使用的引物为 P2/P8,扩增后比对反应的溶解曲线即可 [9] 。除了具有与上述方法同样的高准确性之外,还可以省去琼脂糖凝胶电泳等步骤。Brubaker 等使用该技术对日本鹌鹑和猫头鹰进行性别鉴定的结果显示,雌性样本具有比雄性样本更多的吸收峰,且这种判定在样品质量越好、扩增水平越高的条件下越可靠 [10] 。此外,通过检索国家知识产权局鸽子性别鉴定发明专利情况,一种利用溶解曲线的发明已于 2015 年公布,可见该技术具有一定的研究和应用前景。

4、环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术,即 LAMP(loop-me-diated isothermal amplification)。与 PCR 技术相比,LAMP 能在等温(60~65 ℃)条件下,短时间(通常是 1h)内进行核酸扩增,是一种简便、快速、精确及低价的基因扩增方法。Chan 等设计了 4 对特异性引物,在 60 ℃条件下进行反应 1h,得到了与常规 PCR 同样的鸽子鉴别结果 [11] 。除了扩增时间较短,反应条件要求较低之外,LAMP 技术获得的结果可以使用肉眼直接观察,缩短了检测时间,而且可以通过添加 CuSO 4检测假阴性。

5、展望

鸽子的性别鉴定,特别是早期鉴定对饲养管理、品种培育、选种留种、遗传疾病的防治、种群结构和群体遗传分析等方面都有重要的意义。本文对当前常见的几种鸽雌雄鉴别快速检测技术进行了综述,以鸽子 CHD1 基因为基础,PCR 技术、RT-PCR 技术、实时荧光定量 PCR技术以及环介导等温扩增技术都能够达到这一目的。其中,PCR 技术的操作相对简单,而环介导等温扩增技术则在速度和反应条件上具有优势,两者也都具有需要提取 DNA 模板这一短板。而采用了不提取 DNA 模板的 PCR 技术将这一短板弥补 [12] 。此外,近年来高速发展的核酸探针技术、快速 DNA 聚合酶技术等都将大大提高鸽子性别鉴定的检测效率,进而提高养殖效率,降低养殖成本。

参考文献

[1] 胡锐颖, 李仲逵, 丁小燕. 鸟类性别决定机制及性别鉴定的研究进展. 遗传, 2005, 27(2):297-301.

[2]Griffiths R. Sex identification in birds using two CHD genes. Proceedings of the Royal Society B Bi-ological Sciences, 1996, 263(1374): 1251-1256.

[3]贾晓旭, 牛鲜艳, 何宗亮, 等. 利用羽毛对鸽子进行分子性别鉴定. 农业生物技术学报, 2010,18(5): 1019-1023.

[4]许明, 胡艳, 窦新红, 等. 鸽性染色体 CHD1 基因序列差异的检测新方法. 中国家禽, 2014, 36(23): 10-13.

[5]刘宏祥, 胡艳, 姬改革, 等. 快速鉴定主要禽类性别的一对新的通用引物. 农业生物技术学报,2014, 22(12): 1567-1574.

[6]Ogawa A. Molecular characterization and cyto-logical mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds.Chromosome Research, 1997, 5(2): 93-101.

[7]乔爱君, 马文霞, 李大全, 等. Wpkci 基因用于鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎性别鉴定. 中国农业科学, 2008, 41(3): 841-845.

[8]郑炜, 范丽娜, 翟曼君, 等. 鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎性别的 DNA 分子鉴定. 农业生物技术学报, 2013, 21(4): 428-434.

[9]Huang H W, Su Y F, Yao C T, et al.High-throughput gender identification of three Columbidae species using melting curve analysis.Theriogenology, 2011, 75(1): 1-4.

[10] Brubaker J L, Karouna-Renier N K, Chen Y,et al. A noninvasive, direct real-time PCR method for sex determination in multiple avian species.Molecular Ecology Resources, 2011, 11 (2):415-417.

[11] Chan K W, Liu P C, Yang W C, et al. A novel loop-mediated isothermal amplification approach for sex identification of Columbidae birds. Theri-ogenology, 2012, 78(6): 1329.

[12] 张莉, 单达聪, 刘彦, 等. 通过 CHD 基因快速鉴定鸽子性别方法的研究. 中国畜牧兽医,2016, 43(5): 1379-1384.

作者:梁少杰,高春起,严会超,王修启(华南农业大学动物科学学院,广州 510642)

基金项目:国家自然科学基金项目(31501969);广东省家禽产业技术体系(2016LM1116)

作者简介:梁少杰 (1993-),男,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业,E-mail: l18826476340@163.com

* 通讯作者:王修启(1968-),男,研究员,博士生导师,主要从事畜禽营养相关研究工作。 E-mail: xqwang@scau.edu.cn

责任编辑:罗庆斌

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