禽白血病病毒检测技术进展

禽白血病是由禽白血病病毒引起的能在禽类中导致不同致病型的肿瘤性疾病,能使大多数感染鸡的生产性能下降,造成较大经济损失,是严重影响国内外养禽业安全生产的重要疾病之一。疾病净化是当前防控禽白血病最主要的措施。在禽白血病的净化过程中,检测技术起着重要的作用。本文拟就禽白血病病毒的各种检测技术和鉴别诊断技术作一简要综述,以期为各种禽场制订和实施禽白血病净化方案提供参考。

禽白血病(Avian Leukosis, AL)是由反转录病毒科 α 反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)引起的家禽传染性肿瘤病。鸡感染 ALV 后会导致发病鸡群生产性能下降和免疫抑制,也可导致一定比例的鸡产生肿瘤甚至死亡,是危害我国养禽业健康发展的重要疾病之一。根据病毒囊膜蛋白 gp85 的特性,可将自然感染鸡群的ALV 分为 A、B、C、D、E 和 J 6 个亚群,其中 E 亚群为致病性低或者无致病性的内源性 ALV,其他为对鸡有一定致病性的外源性 ALV。但是,近年来在一些固有地方品种鸡中新发现了 1 种外源性 ALV-K 亚群 [1,2]

A 亚群和 B 亚群在鸡群中主要导致淋巴细胞性白血病以及肉瘤,而鸡群自然感染 C 亚群和 D 亚群比较罕见。随着国外对 ALV 实施了有力的净化措施,到 20 世纪 80 年代末,国外几乎所有大型种鸡公司已将经典的外源性 ALV 基本净化 [3] 。J 亚群禽白血病病毒(ALV-J)是Payne [4] 等于 1988 年在肉用鸡首次分离和鉴定出来的。鸡感染 ALV-J后,会导致髓细胞瘤的发生以及生产性能下降,对世界养殖业造成巨大的经济损失 [5] 。ALV-J 最初被认为只感染肉用型鸡,但其宿主范围有不断扩大的趋势,我国的蛋用型鸡和地方品系鸡也检测出了 ALV-J感染,并逐渐开始向水禽、野鸟蔓延 [6,7] 。王鑫 [1] 从我国地方品系鸡芦花鸡中分离到 3 株外源性 ALV,通过 gp85 氨基酸序列同源性比较分析,初步命名为 K 亚群。随后,郝建勇 [2] 从广东某种公鸡中分离到 2 株ALV-K,且其检出率呈现出逐渐上升的趋势。

对于 AL 的防控,至今仍未报道高效的疫苗和药物,各国控制 AL的主要手段是通过不断的净化而获得无外源性 ALV 的种群。而在 AL的净化过程中,检测技术起着重要的作用。目前国内外已经建立多种检测和鉴别诊断 ALV 的方法,主要包括病毒的分离与鉴定、病理学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法。

1、病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定一直被认为是检测患病禽是否感染 ALV 有效的方法。ALV 可从多种材料中分离出来,例如血液、肿瘤、组织、胎粪、蛋清、精液和拭子等 [8,9] 。病毒分离常用的方法是先无菌操作采集鸡的抗凝血,4℃低速离心后取含白细胞部分的血浆接种于 DF-1 细胞或者 CEF细胞进行病毒的分离与培养。一般在细胞上培养 7~9 天后收获培养物,然后借助聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)和特定亚群抗性细胞系等方法,分别鉴别诊断血浆样品中是否含ALV 并鉴别其亚群。病毒分离鉴定的方法特异性高,一旦分离到外源性 ALV,就能确定该鸡感染了ALV,应及时淘汰阳性鸡。这种方法虽然有效,但是对操作人员的技术要求和检测中的仪器要求较高,尤其是细胞的培养技术。假如没有稳定的实验操作技能,可能导致细胞维持不到足够时间,则影响检出率,可能导致假阴性而“漏检”。病毒分离方法耗费时间较长,较快的结果差不多也要 10 天。目前国内为数不多的几家种禽场已建立起 ALV 病毒分离的工作条件和技术人才队伍,而大多数种鸡场还不具备批量的病毒分离检测工作的条件,而是委托具有相应资质和条件的实验室承担病毒分离的净化检测工作。

对于不同亚群 ALV 的鉴别,可以利用源于具有特定亚群遗传抗性鸡的原代细胞进行,其原理在于 A~E 亚群 ALV 的宿主范围较为严格,不同亚群 ALV 的受体不同,只可惜由于这些品系鸡的稀有性,和原代细胞的不可永久传代以及携带不方便等原因限制了其效能的发挥;也可以利用具有特定亚群抗性的永生细胞系进行鉴别,其主要原理在于利用了 ALV 超感染抗性的特征。美国 ADOL 实验室基于 DF-1细胞系,建立了抗 J 亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染的 DF-1/J 细胞系 [10] ,用于特异性鉴别诊断临床样品中的 ALV-J;国内秦爱建课题组也建立了 DF-1/J 细胞系 [11] 。笔者所在的课题组相继建立了可分别特异性限制 ALV-A、ALV-B、ALV- K 生长的永生细胞系 DF-1/A、DF-1/B 和DF-1/ K [12,13] ,已成功应用于不同亚群 ALV 的鉴别。

2、病理检测技术

病理组织学分析对于鸡场中禽白血病的临床病例诊断是直观的金标准评价方法。在病理诊断过程中,要确认肿瘤是否由 ALV 引起的,首先必须要对病变组织做病理组织切片,染色后观察肿瘤细胞形态可直接进行病理学诊断。如能结合其他病毒学的辅助检测技术就更有助于确诊 [14] 。组织病理诊断方法主要包括病理组织切片技术、免疫组化技术和间接免疫荧光技术等。

2.1 病理组织切片

病理组织切片可利用苏木精 – 伊红染色制作切片,然后在显微镜下观察细胞病变。通过病理组织切片才能确诊患病禽表现出的结节是肿瘤而不是炎症反应,也只有在显微镜下观察切片,才能看得出是哪种细胞类型的肿瘤而作出病理学评判 [14] 。然而即使病理组织切片检测观察到是肿瘤,也不能确诊一定是由 ALV 引起的。除 ALV 能够引起鸡发生肿瘤,马立克氏病病毒 (MDV)、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)等病原也可能引起肿瘤。另外还有些鸡体内的肿瘤为自发性肿瘤,与感染因子无关。所以要确诊是否 ALV 诱发的肿瘤,应具有扎实的肿瘤病理学鉴别诊断经验,还应结合其他检测方法,例如特异性的 PCR 检测或者病毒的分离与鉴定。如果肿瘤的病理组织切片上的胞浆中有大量圆球形嗜酸性颗粒的骨髓细胞瘤性病变,则基本上可以诊断是 ALV-J 引起的 [15,16]

2.2 免疫组化技术

免疫组化法是指利用抗原能够和特异性强的抗体结合,然后通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原分布的方法,借此可以直接观察到组织中的肿瘤细胞。该方法是病理学分析 ALV 蛋白抗原常用的方法 [17] 。张玲娟等 [18] 将组织芯片技术和免疫组化染色结合起来,用 ALV -J 特异性单克隆抗体检测发病鸡各组织器官的组织切片,在肝脏、卵巢、脾脏和髓细胞瘤组织等均检出病毒抗原。但是,免疫组化方法需要特异性抗体来识别抗原表位,国内并非各个实验室都有针对各个 ALV 亚群的特异性抗体,而且对抗原表位的稳定表达性也有要求,所以免疫组化技术实际应用起来也有许多限制。

2.3 间接免疫荧光检测方法(IFA)

IFA 的原理是将荧光色素标记在抗原或者抗体上,然后用荧光显微镜观察抗原和抗体特异性结合后出现的荧光反应。早期由 Smith 等建立了检测 ALV 特异性抗原的荧光抗体检测方法 [19] 。随后有学者研发出了 ALV-A 单克隆抗体,并通过 IFA 来鉴定 ALV-A 变异株,效果较好,具有较高的特异性 [20] 。但该检测方法局限于某些实验室使用,主要是因为操作过程中需要使用荧光显微镜和特异性单抗,这一点在基层是难以满足的,而且有时会产生非特异性荧光的影响,针对各个亚群的特异性单抗也较难获得,所以一定程度上不适宜生产上批量样品的检测。

3、血清学检测

血清学检测是指利用抗原能够与抗体特异性结合的原理从而设计出的一种检测方法。有关 ALV 血清学检测方法主要有病毒中和试验(Neutralization,NT)、琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金免疫层析技术等。

3.1 病毒中和试验

NT 试验是一种检验 ALV 抗原或抗体的血清学方法,具有较强的敏感性。它能够通过病毒被免疫血清中和后的剩余感染力来判定血清中和病毒的能力。ALV 各个亚群只能被其相对应的特异性抗体所中和,而往往不与其他抗体反应。在 NT 试验中,只有病毒表面的抗原与特异性抗体相对应,才能取得好的效果。秦爱建等 [21]用研制的单抗 (JE9、G2、I45 和 J47) 做 ALV-J的中和试验,然后用 ALV p27 抗原 ELISA 检测病毒的复制情况,结果表明单抗可以中和病毒。该方法被认为是检出 ALV-J 一种比较特异的方法。但由于 ALV-J 分离物中往往存在抗原多样性,所以选择合适的 ALV-J 特异性血清进行中和试验对于准确结果的获取是较重要的。NT试验的优点在于能够检测批量的样品。缺点就是操作繁琐,需要的时间较长且抗体材料要求高,因此在实际工作中已较少用此种诊断方法。

3.2 琼脂扩散试验

AGP 就是通过抗原和抗体在凝胶内发生结合形成沉淀从而检测出病毒抗原或抗体的方法,是最早可以进行临床检测的方法之一 [22] 。20世纪 80 年代哈兽研利用 AGP 的方法检测羽髓中的 ALV。该方法操作相对容易,费用经济,可应用于临床检测,曾对我国早期种鸡场 AL 的净化起了一定的作用 [23] 。但该方法的缺点在于拔羽过程中会一定程度上引起鸡的应激反应,而且还有可能会出现一部分比例的假阳性,目前这种方法已经较少使用。

3.3 酶联免疫吸附试验

ELISA 技术可用于检测抗原或抗体,具有灵敏、快速和便捷等优点。检测 ALV 可以利用多种方式,例如间接 ELISA、竞争 ELISA、阻断ELISA 和单抗捕捉 ELISA 等。ELISA 的优点在于省时,可批次处理样品,操作相对简便,也不需要太复杂的实验仪器,适用于胎粪、蛋清、血清、拭子、精液、活疫苗和细胞培养物等各种样品的检测。就目前检测 ALV 而言,ELISA 方法可一次大批量检测送检净化样品,已成为众多种禽公司进行禽白血病净化主要的检测技术。但是,必须指出的是,目前市售的国内外 ALV抗原 ELISA 试剂盒主要基于检测 p27 抗原来判定 ALV 的存在,而 p27 抗原在内源性 ALV和外源性 ALV 中均高度保守 [24] ,因此在净化检测过程中,如果是对胎粪、蛋清、拭子和精液等样品直接进行 ALV p27 检测,则其检测结果中容易出现“假阳性”,尤其是我国有不少地方鸡品种,其内源性表达量往往较高,因此在对这些品系进行净化检测结果判定时,必须要谨慎,否则易因“误杀”而对品种选育造成一定程度的损失。如果能将血浆、蛋清和精液等样品基于DF-1 细胞进行病毒分离 7~9 天后,然后取其培养物再进行 ALV p27 抗原 ELISA,则可以明显消除“假阳性”带来的影响。大量的研究表明:虽然 ALV 先天感染或早期感染后,鸡一个世代往往存在几个排毒高峰,但是由于 ALV 在鸡体内排毒的不可预知性,因此对于鸡只个体而言,一个世代中通过单次或若干次的基于蛋清或泄殖腔棉拭子的 ALV p27 抗原 ELISA 检测,仍然存在“漏检”的可能性。因此在 ALV 净化过程中,选择一个性价比高稳定性好的抗原试剂盒关系重大,值得认真权衡选择。

3.4 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是利用硝酸纤维素膜为固相载体,胶体金作为示踪物,结合免疫层析技术进而抗原与抗体能够形成免疫复合物来显色的一种技术。该技术的特点在于检测快速、便捷,不需要特殊的实验仪器以及专门的操作人员。该项技术已在多种疾病的检测和防控中发挥了重要作用,例如检测 H9 亚型禽流感、犬心丝虫病等。在对禽白血病的诊断中,胶体金快速检测试纸条比起 ELISA、IFA 等检测技术有着独特的优势,该技术已被应用于一些种鸡场核心群的净化过程中,梁有志等 [25] 利用抗 ALVp27 蛋白的单克隆抗体 5D3 进行胶体金标记为胶体金 – 抗体复合物,喷于玻璃纤维膜上制成金标垫,同时将抗 ALV p27 蛋白的另一种单抗4F12 和兔抗鼠 IgG 抗体包被在硝酸纤维素膜上分别成为检测线和质控线,从而制备出 ALV抗原胶体金检测试纸条,结果显示该试纸条具有良好的特异性和稳定性,与商业 ELISA 试剂盒检测结果相比符合率达到 93%。2015 年,Kun Qian 等 [26] 利用同样的单抗 5D3 和 4F12 制作胶体金检测试纸条,在优化条件后,检测观察时间只需 5min,但灵敏性由 70ng/mL 提高到600pg/mL。ALV 抗原胶体金快速检测试纸条如能进一步优化和改进稳定性,则可相信该技术将在实验室及临床的应用上有着巨大的潜力,或许对推进 AL 净化的进程起着重要的作用。

4、分子生物学检测

ALV 的分子生物学检测方法包括直接PCR、多重 PCR、反转录 PCR(RT-PCR)、荧光定量 PCR、环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification, LAMP)和寡核苷酸微阵列技术(Oligonucleotide microarray)等。

4.1 直接 PCR

采用 PCR 方法检测病毒的特异性核酸来诊断病毒性疾病是实验室常用的方法之一。多个兽医实验室已具有利用直接 PCR 来检测病料或者疫苗中 ALV 的能力,与其他常用血清学检测方法相比,PCR 方法因其灵敏度高而具有独特的优势,即使微量的 DNA 样品也能被检测出来。PCR 技术可用于特定亚群 ALV 的快速检测,但此方法也有局限性,存在扩增出非目的条带序列的可能性,所以采用单一的 PCR 技术检测 ALV 可作为初步诊断的参考。如果要提高PCR 检测结果的可信度,最好能对直接 PCR 产物进行测序或者利用分子杂交的方法。此外,如果病毒发生关键的核酸变异,则普通 PCR 可能无法检测出来。

4.2 多重 PCR

考虑到鸡 ALV 有多个亚群,因此如需对多个亚群引起的混合感染进行鉴别检测,针对单一亚群 PCR 比较费时费力,浪费试剂。Qi Gao等 [27] 设计了 1 个通用的上游引物,3 个下游引物,优化反应条件,可以根据片段的大小,同时检测 ALV A、B 和 J 亚群。Sathish Gopad 等 [28] 同样用多重 PCR 检测 MDV、REV、ALV 及其 J 亚群等致瘤性病毒,这为快速诊断多重感染提供了便利的方法。Tingting Zeng 等 [29] 设计嵌合引物,利用多重 PCR 的方法,可以同时检测 8 种禽免疫抑制病病毒。多重 PCR 的方法可以 1 次检测多个 ALV 亚群。其关键点是需要设好特异性引物,优化反应条件等。

4.3 反转录 PCR(RT-PCR)和荧光定量 PCR

RT-PCR 能够检测病毒的 RNA,敏感性高,且比直接 PCR 能够更准确地检测 ALV 的存在。张立成等 [30] 利用 1 对 ALV p27 基因引物,提取病鸡不同组织 RNA 后利用 RT-PCR 的方法扩增,发现羽髓组织提取的 RNA 相对容易扩增出目的条带且敏感性较高,可惜常规 RT-PCR不能准确定量病毒。荧光定量 PCR 是以荧光探针为核心的实时定量检测指定核酸的技术。该技术可以有效地对病毒定量,具有高度的灵敏度、特异性,检测用时少、自动化程度高及不易污染等特点。Qin L 等 [31] 建立了基于 TaqMan 探针的荧光定量 PCR 方法,可以快速检测和定量ALV-J。Manman Dai 等[32]利用 SYBR Green IRT-PCR 特异性鉴别诊断 ALV-A、ALV-B 和ALV-J。相比荧光定量 PCR,SYBR Green IRT-PCR 相对便宜和方便,不需要特定的探针而需要特定的引物。

4.4 免疫 PCR (Immuno PCR, Im-PCR)

Im-PCR 是利用抗原能够和抗体特异性结合,以及结合 PCR 的较高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。而邻位连接技术(Proxim-ityligation assay, PLA) 是一种高度敏感的新技术,能够将蛋白质的检测转变成核酸序列的检测。已有研究表明,PLA 的敏感性高于 PCR 和ELISA [33,34] 。Quan Xie 等 [35] 利用 PLA 结合 PCR 和免疫方法来发展 Im-PCR 技术,结果说明Im-PCR 具有高特异性和灵敏性,能够检测 0.5TCID 50 的 ALV,而且结果与商业 ELISA 试剂盒相符,并且不需要像病毒分离那样需要等待 7~9 天的时间。

4.5 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP 是 Notomi 等 [36] 在 2000 年发明的一种体外恒温核酸扩增方法。特点是不需要像PCR 反应频繁的温度变化,全程只需要同一温度下进行。因此这对仪器的要求就降低了许多,只需要普通恒温的仪器即可。Zhang 等 [37] 建立的针对 ALV-J 的可视化 LAMP 检测技术,其敏感性比普通 PCR 高 10 倍,可以在 1h 内完成检测过程。同年,Wang 等 [38] 建立了针对 ALV-A 的LAMP 检测技术。2015 年,Hao Peng 等 [39] 利用 4对特异性 LAMP 引物,也建立了可检测 ALV 的LAMP 方法,63℃ 35 min 即可检测 ALV。

4.6 斑点杂交技术

斑点杂交技术是将待检样品点到硝酸纤维膜上,然后与标记过的探针杂交后进行检测的方法。周刚等 [40] 利用了 ALV 各亚群的 p27 部分基因片段设计合成了地高辛标记探针,建立了能够利用斑点杂交技术检测 ALV 的方法,检测结果能与 PCR 相符,具有检测 SPF 鸡胚以及疫苗等临床样本的潜力。崔治中等 [41] 利用 ALV 不同亚群中基因组 3’末端的 U3 片段的独特区设计合成了各个鸡 ALV 亚群的特异性核酸探针,经地高辛标记后,利用这些探针进行斑点分子杂交,以检测样品中有无致病性外源性 ALV 特异性核酸的存在。目前基于斑点杂交技术已广泛应用于活疫苗中污染外源性 ALV 的检测和筛查。

4.7 基因芯片技术(Gene chip assay)

基因芯片技术又叫 DNA 微阵列技术,其原理是基于碱基互补配对,再进行核酸分子杂交检测,是一种易于使用,具有高度专一、高灵敏度和可扩展分析的方法。前面的诊断技术中已经有多重 PCR 可以区分 ALV 的亚群,但是这些技术都不能同时区分 ALV 的亚群和其他肿瘤病病原。而基于基因芯片开发出的这种技术,可以在区分 ALV 各亚群的同时也与其他禽病病原区别开来。张悦等 [42] 根据 NCBI 上 ALV 的B、E 和 J 亚群保守的 env 序列设计合成 5 条寡核苷酸探针制作寡核苷酸探针芯片,然后利用多重 PCR,并用 Cy3 标记扩增产物,再与基因芯片进行杂交反应后检测。该方法能准确检测ALV 的 3 个亚群,且灵敏度能够检测到 10 2 个基因拷贝。朱瑞豪设计了 10 条特异性寡核苷酸探针,建立了禽类 3 种免疫抑制病的基因芯片检测技术,能够区分 ALV 的 A、C 和 D 亚群,以及鸡传染性贫血病病毒(CIAV)和 REV [43] 。2016年,Wang 等 [44] 利用微阵列技术,设计出的寡聚核苷酸探针能同时快速检测区分 ALV 及其亚群,以及有致瘤性的 MDV、REV 的基因芯片。微阵列技术有替代 PCR 的潜力,可以同时在一块芯片上对多个样本进行多种疾病病原的检测,因此可以提供更好的诊断效率。这是家禽鉴别诊断的一项高通量革新式技术,只是目前价格相对昂贵,如能进一步改善则在将来或许能发挥更好的作用。

5、小结

随着 《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020 年)》的贯彻落实,农业主管部门和养禽业越来越重视禽白血病,并逐步意识到疫病净化的重要性,对种禽群实施禽白血病净化已成为行业共识。随着科学技术的日新月异发展,各种 ALV 净化检测方法也在不断完善优化中。种禽生产企业在启动和实施禽白血病净化过程中,应事先充分认识各种检测方法固有的优缺点,同时结合企业自身的实际情况,选择合适的检测方法组合,并在净化过程中不断根据净化进程调整和优化净化方案。技术研发单位也应加大力度,不断研制、改进轻简化的禽白血病病毒检测技术,以更好地服务于生产实践,为早日实现禽白血病净化目标提供坚实的技术保障。

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作者:郑晓翠,曹伟胜*(华南农业大学兽医学院,广州510642)

* 通讯作者;国家重点研发计划(2016YFD0501606); 广东省科技 计划项目(2015A020209145);广东省家禽产业技术体系疾病控制岗位 专 家 (2016LM1114); 国 家 肉 鸡 产 业 技 术 体 系 岗 位 科 学 家 (CARS-42-G09)

责任编辑:任涛

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