1株禽传染性脑脊髓炎病毒分离鉴定及致病性研究

禽传染性脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis,AE)是当今世界危害养禽业的主要疫病之一,对养禽业造成了巨大经济损失。本文从自然发病的雏鸡脑组织中分离到禽传染性脑脊髓炎病毒 GD-S-29株,进行了致病性研究,并据此提出了防治措施。

禽传染性脑脊髓炎(AvianEncephalomyelitis,AE) 又称鸡传染性脑脊髓炎,是由禽传染性脑脊髓炎病毒(AEV)引起的主要危害 4 周龄以下雏鸡,侵害雏鸡中枢神经系统的高度接触性传染病。该病毒可引起成年鸡产蛋率降低,4 周龄以下雏鸡头颈震颤、运动失调、后肢麻痹等神经症状和非化脓性脑炎 [1] 。雏鸡发病率一般为 20%~60%,死亡率平均为 25%,甚至达到 50%以上 [2] 。我国最早于 20 世纪 80 年代有该病毒的报道,其传播途径为接触水平传播或蛋媒垂直传播,传播速率高 [2,3,4]

笔者从疑似发生禽传染性脑脊髓炎的广西某种鸡养殖场采集样本,进行 AEV 的分离鉴定及致病性研究,结果报道如下。

1、材料

1.1 病料

无菌操作采集广西某养禽场自然发病、经初步诊断为 AE的濒死雏鸡的脑和十二指肠等组织样品。

1.2 SPF 鸡胚和 SPF 鸡

为山东济南斯帕法斯家禽有限公司产品。

1.3 主要试剂

DL-2000/5000 DNA Mark-er、核酸染料、6 ×LoadingBuffer、一步法反转录试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品;琼脂糖为北京天根生化科技有限公司产品;琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、RNA 抽提试剂盒为杭州爱思进生物技术有限公司产品。

2、方法

2.1 病毒的分离

将上述病料置于玻璃研磨器中用液氮充分研磨,收集悬液,反复冻融 3 次,超声波处理后于 4℃ 10 000 r/min 离心5min,取上清,用 0.22 μM 微孔滤膜过滤,以 0.2mL/ 枚的剂量接种于 6 日龄 SPF 鸡胚卵黄囊中,7 天后收毒,置于 -80℃下保存。

2.2 RT-PCR 鉴定

根据 GenBank 发布的AEV Calnek-1143 株序列(AJ225173.1)设计特异性引物(P1:5′-ATGGGGAAAGAGGATGAAGGA-3′,P2:5′-CGACCTACTCTTCTACCAACTC-3′)用于病原的检测,扩增目的基因大小为 810 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司广州合成部合成。按 RNA 抽提试剂盒和一步法反转录试剂盒说明书进行病毒 RNA 的提取和反转录,并以反转录的cRNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增程序:50℃反转 录30min,94℃预变性 5min,94℃变性 30s,55℃复性 30s,72℃延伸 60s,共 30 个循环;后72℃再延伸 10min。用 1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,在 120V电压下电泳 20min,取出凝胶于紫外投射仪中观察。最后按琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书进行 PCR 扩增产物的回收和纯化,送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。

2.3 人工攻毒试验

取 1 日龄 SPF 雏鸡 20 羽,随机分为 2 组,每组 10 羽。第1 组为试验组,每羽雏鸡脑内接种 0.1mL 病毒液,第 2 组为空白对照组,每羽雏鸡脑内接种 0.1mL 生理盐水。分别饲喂于 2 个负压隔离器中,观察并记录各组雏鸡发病情况和病死鸡体内组织的病理变化。

3、结果与分析

3.1 病毒分离及 RT-PCR 鉴定结果

如图 1 所示,经实验室分离和 RT-PCR 扩增得到的病毒株基因,发现在 810bp 处有特异性条带,与预期目标一致。结果提示分离到的病毒含有AEV,命名为 GD-S-29 株。

3.2 人工感染试验结果

观察结果如图 2 所示,攻毒后第 5 天 GD-S-29 株组雏鸡陆陆续续开始发病,病鸡出现精神不振、头颈振颤低垂、两腿站立不稳或直接倒地等明显的 AE 症状,2~4 天内均会死亡 [5,6] 。而对照组鸡生长、采食和健康状况等均未发生异常。

剖检观察结果,与对照组相比,GD-S-29 株攻毒组剖雏鸡的脏器未出现明显的病变,仅脑部存在明显的出血和萎缩等。HE 染色的病理切片分析显示,GD-S-29 株组发病雏鸡大脑皮层组织结构松散,部分神经元细胞深染,神经元结构不清晰(图 3B 下箭头所示);胶质细胞较空白组少量增生(图 3B 上箭头所示)。

4、防治措施

4.1 加强生产管理

采取严格的消毒和卫生防疫措施;严禁从疫区引种;科学饲喂复合维生素、中草药等添加剂以增强鸡群抵抗力;种鸡表现疑似 AE 症状(如产蛋率突然下降)后 1 月内所产蛋不可用做种用;雏鸡发病可全群淘汰等 [7,8]

4.2 种鸡免疫接种

该病尚缺有效的药物治疗,目前多采用疫苗免疫种鸡。疫苗有 2 种,分别为弱毒活疫苗和灭活苗,在非疫区应避免使用活疫苗。以免疫开产前 4周以上的鸡群为宜,两者均可对种鸡产生良好的免疫保护效果,并且产生的母源抗体能达到保护仔鸡的效果 [8,9]

参考文献

[1]王纯洁,马学恩,赵振华. 禽传染性脑脊髓炎研究进展 [J]. 动物医学进展, 2003(02):45-48.

[2]方博,付新亮,张桂红. 禽传染性脑脊髓炎及其防控 [J]. 广东饲料, 2016 , 25 (9) :47-49.

[3]Calnek B W, Taylor P J,Sevoian M. Studies on Avian En-cephalomyelitis. IV Epizootiology[J]. Avian Dis, 1960,4(4) :325.

[4] Y.M.Saif.,苏敬良等译. 禽病学(第十一版)[M]. 北京:中国农业出版社 , 2005.

[5] 刘思当,肖世坤. 禽传染性脑脊髓炎病毒的分离与初步鉴定研究[J].山东农业大学学报自然科学版, 2000,31 (1) :3-4.

[6] 郝华芳,张淑霞,杨涛,等. 禽传染性脑脊髓炎病毒 YL 株的分离鉴定 [J]. 中国兽医杂志,2014,50 (2) :24-26.

[7] 杭柏林. 禽传染性脑脊髓炎的诊断与综合防治技术 [J]. 科学种养, 2011 (2) :45-46.

[8] 吉林巴雅尔. 禽传染性脑脊髓炎的流行特点及综合防治措施 [J]. 畜牧与饲料科学, 2013 ,34 (4) :114-115.

[9]刘连军.禽传染性脑脊髓炎的防治 [J]. 中国 动物 保健 ,2016, 18 (6) :37-38.

作者:杨镇玮1郑瑶瑶1张帆1邵冠明1李眈眈1谢青梅1,2*(1 华南农业大学动物科学学院,广州 510642;2 广东省畜禽健康养殖与安全生产重点实验室,广州 510642)

* 通讯作者:谢青梅,女,教授,博士生导师,E-mail: qmx@scau.edu.cn

责任编辑:曹伟胜

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