浅谈如何提高ELISA测定的准确性

近几年,畜产品质量安全意识与日俱增,动物疫病形势复杂化,基层动物疫病防控部门做好动物疫病筛查工作显得尤为重要。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点被广泛应用于血清、尿和饲料等样品筛检中。ELISA 试验看似简单但在实际的操作中,影响测定结果的因素较多,稍有不慎便会导致弱板、白板、花板等不正常现象或假阳性、假阴性等异常结果。笔者对 ELISA 测定过程中出现一些问题进行了分析和总结,要想做好 ELISA试验需 3 个方面着手。

1、试剂

检测试剂应选择正规厂家、灵敏度高、特异性好和操作方便省时的试剂,切忌混用同厂家生产的不同批号的试剂。另外,试剂在使用前应平衡至室温(25℃左右),这样可以避免试验反应不充分、弱阳性样品检测假阴性结果等现象的发生。此外,稀释试剂的水必须使用重蒸水或去离子水,其他水因杂质过多或有酸碱度都会影响检测结果的准确性。

2、样品

2.1 样品处理

ELISA 测定结果的判定是通过辣根过氧化物酶(HRP)与特异性结合产生的抗原 – 抗体复合物相互作用后显色与否来实现的。对样品筛选或处理要严格,否则会直接导致结果呈假阳性或假阴性等异常现象。如溶血和被细菌污染的样品、冰箱中保存过久的样品等导致假阳性出现;反复冻融会使样品效价降低,导致假阴性出现。一般来说,1 周内测定的4~8℃冷藏保存,1 周后测定的-20℃冷冻保存,长期保存多次测定的样品要分装冰冻保存。

2.2 样品稀释

凡是 ELISA 检测试剂盒,均要求将样品稀释至适当的倍数,并且不同试剂盒对样品稀释倍数均有严格规定,以降低非特异反应的概率,同时保证试验的灵敏度和特异性。若操作者未能理解其意义,没有严格按照说明书操作,导致移取计量不精准,造成样品稀释倍数相差甚远,那么检测结果肯定会出现严重偏差。

3、操作

3.1 加样

首先加样不可太快,否则无法保证加样剂量的准确性和均一性。其次要避免将液体加在反应孔壁上部,可能会导致非特异性吸附。此外,要做到一份样品一个移液枪头,以防交叉污染。

3.2 温育

温育是 ELISA 测定中的一个关键环节,只有在一定适宜的温度和与之相对应的特定时间,液相中的抗原(抗体)才能与固相载体上的特异抗体(抗原)充分结合。不同试剂盒有不同的温育温度和时间的要求,应严格按试剂盒说明操作,不能人为改变。此外,微孔板温育时要加贴封片,这样可以防止孔内液体蒸发或水珠等杂质滴入孔内影响检测结果。

3.3 洗板

洗板是将温育过程中液相非特异性成分与反应中固相载体的抗原(抗体)结合产生的抗原抗体清除出去,从而保证ELISA 测定的特异性。同样,每个试剂盒对洗板的次数和浸泡时间都有明确规定,绝不能擅自更改。此外,洗涤液应现用现配,洗板时不要让洗液溢出,每次甩板拍干后的吸水纸一定要更换,尤其是拍过酶标记物的吸水纸,否则影响试验结果。

3.4 显色

一般来说,显色时间过短,结果偏低,显色时间过长,对照值偏高或非特异性显色概率增加,因此,显色一定要严格按照说明书要求控制好时间。此外,不同试剂盒对酶标仪的波长有明确要求,上机时需稍加注意。

此外,在反应板上的整个操作过程,操作手法应一致,加样时避免产生气泡,以免反应不完全或比色结果不准确。

总之,只要操作者按照说明书要求操作,专心细致,精益求精,就一定能大大降低异常结果出现的概率,体现 ELISA试验的优越性。

作者:高秀妹,曹红收,刘占艳(山东省无棣县畜牧兽医局,山东滨州 251900)

责任编辑:曹伟胜

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