1例三黄鸡J亚群禽白血病的诊断报告

广东惠州某公司于2016 年 10 月引进一批 120 日龄三黄鸡,上笼后每月死亡率达 2.35%,经过流行病学调查、病原分离鉴定等诊断为 J 亚群禽白血病。

禽白血病是禽类一种重要的病毒性肿瘤性疾病,主要引起患禽发生肿瘤,造成产蛋率、蛋的品质和胴体品质下降,还可造成免疫抑制以及死淘率增加等。

禽白血病病毒(ALV)属于反转录病毒科、α 反转录病毒属。鸡源禽白血病病毒分成 A、B、C、D、E、J 亚群和新发 K 亚群,其中的 E 亚群属于内源性ALV,没有致瘤性;而 A、B、C、D、J 和 K 亚群均属于外源性ALV,可引起鸡的肿瘤性疾病。在这些外源性 ALV 中,以 J 亚群鸡白血病病毒(ALV-J)对鸡的致病性最强 。研究认为ALV-J 是由外源性和内源性禽白血病病毒重组而成的新亚群,主要引起免疫抑制、生长抑制和髓细胞癌变为特点的髓细胞瘤或成髓性白血病。该病在欧美国家流行数年,给家禽育种行业造成沉重打击,多家育种公司因受 J 亚群禽白血病病毒感染而受市场淘汰。

杜岩等 [1] (1999)首次从我国商品肉鸡中发现 ALV-J 引起的髓细胞瘤白血病,随后该病逐步扩散至蛋鸡和中国的地方鸡种等 [2-3] 。在 2008-2010 年公益性行业(农业)科研专项“鸡白血病流行病学和防控措施的示范性研究”、2012-2016年公益性行业(农业)科研专项“种鸡场禽白血病防控与净化技术的集成”、2008-2015 国家肉鸡产业技术体系以及2016-2020 年国家重点研发计划专项“种禽场高致病性禽流感、新城疫、禽白血病、沙门氏菌病综合防控与净化技术集成与示范”的支持下,主管部门和种禽生产企业分别采取净化、严格的生物安全、选择优质疫苗和宣传教育等综合防控措施。这几年来大范围发生的、影响巨大的禽白血病案例明显减少,但是在我国部分省份仍有散发病例。本文通过对广东惠州 1 例三黄鸡肿瘤病进行流行病学调查和实验室诊断,确诊为 J 亚群禽白血病。

1、发病情况

惠州某种鸡场于 2016 年10 月引进 7 470 只 120 日龄三黄鸡,上笼后,淘汰 363 只,最终存栏 7 089 只。2016 年 10 月13 日至 2017 年 4 月 28 日期间鸡的死亡率一直降不下去,累计死亡 1 052 只,平均月死亡率达到 2.35%;对其死亡率、产蛋率、受精率和出孵率进行跟踪统计,结果显示平均每月死亡率最低 1.86%,最高可达2.79%(见图1);在 27 周龄时,鸡群周产蛋率峰值为 71.64%,仅维持 1 周时间(见图 2);周受精率在 90.34%和 94.39%之间波动,而出壳率在 85.2%~91.29%之间(见图 3)。

2、剖检病变

对病鸡进行剖检,发现部分病鸡在脚趾和肉髯处出现血管瘤(见图 4),破溃后流血不止至死亡;单侧肾出现肿瘤(见图 5);肝脏和脾脏明显肿大(见图 6),个别鸡胸骨内侧有肿瘤结节(见图 7)。

3、PCR 检测及序列分析

参考文献[4-6]设计合成REV-LTR,MDV-MEQ,ALV-P27 和 ALV-A/B/J 多 重 PCR等鉴定引物,合成 ALV-J env扩增引物;合成本实验组设计的针对 ALV-K 的特异 性引物。将采集的抗凝血血浆接种到 DF-1 细胞上,培养 9 天后提取其细胞的基因组 DNA,同时提取病鸡肝脏组织的 DNA分别进行 PCR 检测,用 REV引物检测样品,结果均为阴性;通过 ALV-P27 引物检测样品,其中编号为 G01,HZS51,HZS52,HZS54 的样品检测为阳性(目的条带 545bp,见图8);用 MDV-MEQ 引物检测样品,结果均为阴性;通过 A/B/J亚型 ALV 多重 PCR 引物检测样品, 其 中编号为 G01,HZS51,HZS52,HZS54 的样品为 J 亚 型 ALV (目的条带422bp);用 ALV-K 亚型引物检测样品,结果均为阴性(见图9)。

用 ALV-Jenv 基因扩增引物对 HZS51,HZS52 和 HZS02毒株进行 PCR 扩增,扩增产物经凝胶电泳后目的条带按照琼脂糖凝胶回收说明书进行回收,产物与 pMD18-T 载体进行连接,16℃连接仪上过夜,将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,涂板培养,37 ℃温箱内培养 12~16h 后,挑取单个菌落扩大培养,菌液 PCR 鉴定阳性后送艾基公司进行基因核苷酸序列测定。利用 DNAStarLasergene.7.1 软件对 env 核苷酸序列做相似性比较,使用MEGA5.0 邻接法(NJ)构建遗传进化关系。HZS51,HZS52 和HZS02 分离株 env 基因核苷酸相似性在 98.2%~98.6%,位于同一分支内;与 GX15MM6-2和 GDQY1201 毒株的核苷酸序列相似性为 97%~ 97.4%,位于同一分支内,说明它们亲缘性较近;与同是广东三黄鸡分离株GD06SL2,GD06SL4,GD0510A 核苷酸序列相似性为 90.7%~96.5%,位于不同的分支内 ; 与英国原型株HPRS-103,美国毒株ADOL-7501 的核苷酸序列相似性为 90.3%~94.9%,位于不同的分支内;与江苏分离株NHH,山东分离株 SD07LK1,本实验组分离毒株SCAU-HN06 的核苷酸序列相似性为 94.2%~95.8%,位于不同的分支内(见图 10)。

4、ALV-p27 抗原 ELISA 检测和 IFA

将采集的抗凝血和肾肿瘤组织研磨过滤液接种到 DF-1细胞上,培养 9 天后,取细胞上清做 ALV P27 抗原检测,有66.7%(4/6)为阳性;将分离株HZS02,HZS51 和 HZS52 接种到 DF-1 细胞上,接种 72h 后拿出,用 PBS 液体洗涤 3 次,5min/ 次;用冷的固定液(丙酮:乙醇 =3:2)固定 8min;自然干燥后,加入 ALV-J JE 9 单抗(1:200 稀释),37℃孵育 1h;PBS洗涤 3 次,5min/ 次;加入 FITC标记的羊抗鼠 lgG 作为二抗,37℃孵育 45min;PBS 避光洗涤 4 次,5min/ 次,最后加入一滴 50%甘油,置荧光显微镜下观察并拍照,结果见图 11。

5、肝脏组织病理切片

取剖肿瘤病鸡肝脏组织,用 10%福尔马林固定 48h,流水冲洗过夜,系列酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡,使用轮转式切片机进行常规石蜡切片(厚度为 5μm),H.E 染色,镜检。可以看出肝脏出现结节性增殖灶,内含大量形态一致的肿瘤细胞,肿瘤细胞略呈圆形,核仁清楚,胞质中聚集嗜酸性颗粒(见图 12,13)。

6、讨论

我国已将禽白血病列为二类动物疫病并将其列入《国家中 长期 动 物 疫 病 防 控 规 划(2012-2020 年)》中优先防治动物疫病名录,积极引导种禽业开展禽白血病的净化 [7] 。由于我国地方品种鸡种类繁多,数量庞大,分布区域较广,因此对AL 的防控难度较大。国内外经验证明禽白血病的防控主要是做好种鸡净化 [8]

ALV-J 呈世界性分布 [9-10] ,它与其他 ALV 亚群间的抗原性差异最大且致病性和传染性最强 [11] 。近年来,我国时有关于血管瘤型 J 亚群禽白血病的报道 [12] 。辛朝安等 [13] 最早报道了安徽、河南等鸡场出现一种以趾、翼、胸部皮肤以及肝脏等器官外表有血疱的病例;齐新永等 [8] 分别于 2007 年和 2011 年2 次报道了上海地区的三黄鸡品系的商品蛋鸡暴发海绵状的血管瘤。国内蛋用型鸡和部分黄羽肉鸡发生的 ALV-J 感染群中,血管瘤,特别是皮肤血管瘤的发生率较高,严重的鸡群达到 10%~15% [14]

本文从临床主要表现为血管瘤的案例中分离到 3 株ALV-J;从采集的抗凝血中,ALV-J 的检出率达到 66.7%,没有检测到 MDV 和 REV。从鸡群死亡率曲线图可看出,20周龄到 45 周龄期间,月死亡率高达 2.79%,鸡群的累计死亡率达到 14.84%;从产蛋率曲线图可看出,70%的产蛋率只维持 1 周,感染 ALV-J 的鸡群虽然可以达到产蛋高峰,但是维持的时间较短,较快降下来;从受精率和出壳率曲线图可看出,平均受精率和出壳率分别为 93.14%和 88.55%,与正常鸡群的受精率和出壳率相差1%~2%。由此可以看出,ALV-J 不仅会引起鸡群的不正常死亡,还会对产蛋率、受精率和出壳率有一定的影响。

通过对分离株 HZS51,HZS52,HZS02 的 env 序列核苷酸遗传进化分析,发现分离株与广西南宁 2015 年分离的 GX15MM6-2 的毒株同源性最近;与同是广东三黄鸡分离毒株 GD06SL2,GD06SL4,GD0510A 在不同的分支上。崔治中等 [15] 证实 ALV-J 主要是在我国引进未经检疫的白羽肉用群种鸡时所带入的。20 世纪90 年代,我国南方不少地方开始将白羽肉鸡公鸡与本地种鸡杂交,在这一育种过程中可能也将 ALV-J 引入了黄羽肉鸡 [9] ,这可能是广东一些黄羽肉鸡地方品种感染 ALV-J 的主要原因。

参考文献

[1]杜岩,崔治中,秦爱建,等.鸡的 J 亚群白血病病毒的分离及部分序列比较[J].病毒学报,2000,16(4):345-346.

[2]Xu BR,Dong WX,Yu CM,et al. Occurrence of avian leukosis virus subgroup J in commercial layer flocks in China [J].Avian Pathology,2004,33(1):13-17.

[3]Shuhong Sun,Zhizhong Cui,et al. Epidemiological and patho-logical studies of subgroup J a-vian leukosis virus infections in Chinese local“yellow”chickens [J].Avian Pathology,2007,36 (3):221-226.

[4] Qi Gao,Bingling Yun,Qi Wang,et al. Development and Application of a Multiplex PCR Method for Rapid Differential Detection of Subgroup A, B, and J Avian Leukosis Viruses [J].Journal of Clinical Microbiology,2014,52:37-44.

[5] Ning Cui, Shuai Su,Peng Sun,et al.Isolation and pathogenic analysis of virulent Marek’sdis-ease virus fieldstrain in China[J].Poultry Science,2016,95:1521-1528.

[6]张丽娟,龚振华,管远红,等.一种用于马立克病病原检测的PCR 技术研究[J].江西农业大学学报,2014,36(1):217-218.

[7]高鸿宾.农业部副部长解读《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》[J].中国兽医杂志,2012(08):1-3.

[8]齐新永,张维谊,鞠厚斌,等.三黄鸡临床多发性肿瘤相关的J 亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其病理学观察[J].中国预防兽医学报,2011,33(2):101-104.

[9]Cui,Z.,Du,Y.,Zhang,Z.,et al.Comparison of Chinese field strains of avian leukosis subgroup J viruses with prototype strainH-PRS-103 and United States strains [J].Avian Diseases,2003,47:1321-1330.

[10]Thapa,B.R.,Omar,A.R.,Ar-shad,S.et al. Detection of avian leukosis virus subgroup J in chicken flocks from Malaysia and their molecular characterization[J].Avian Pathology, 2004, 33:359-363.

[11]崔治中.禽白血病[M].第 1版. 北京: 中国农业出版社,2015,30-31.

[12]侯新华, 申茂欣, 鹿欣伦,等. 蛋鸡血管瘤型 J 亚群禽白血病病毒的分离与鉴定 [J].中国家禽,2011,33(3):26-29.

[13]辛朝安, 曹伟胜, 罗开健,等. 鸡血管瘤型白血病诊断初报[J].养禽与禽病防治,2006,2(11):2-3.

[14]崔治中. 禽白血病病毒研究的过去、现在和将来[J].生命科学,2012,24(4):305-309.

[15]Cui Z,Du Y, Zhang Z,et al.Comparison of Chinese field strains of avian leukosis subgroup J viruses with prototype strain HPRS-103 and United States strains [J].Avian Diseases, 2003,47(4):1321-1330.

作者:张杰、曹伟胜 (华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广州 510642)

基金项目 : 广东省家禽产业技术体系(2017LM1114); 国家肉鸡产业技术体系 (CARS-41-G16)

责任编辑:曹伟胜

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