鸭坦布苏病毒感染研究进展

2010 年初,我国多个省份相继发生了以产蛋下降为特征的新发传染病,对我国鸭养殖产业造成了巨大的经济损失。经过研究,鸭坦布苏病毒被确定为该传染病的病原。本文围绕该病的病原特征、临床症状、病理变化、病原检测方法、病毒基因组分析及疫苗研究进展等方面进行综述,以期为鸭坦布苏病毒感染的进一步研究提供帮助。

鸭坦布苏病毒感染是一种由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus, DTMUV)引起的,产蛋鸭以产蛋下降为主要症状,雏鸭、育成鸭以病毒性脑炎为主要症状的接触性传染病。本病可危害多个鸭品种,如肉种鸭中北京鸭、樱桃谷鸭,蛋鸭中绍兴鸭、山麻鸭、缙云麻鸭和金定鸭等 [1] 。自 2010 年 4 月我国江浙地区发生该病后,坦布苏病毒感染目前已经成为危害我国鸭养殖业最重要的疫病之一,在造成巨大经济损失的同时,也给我国养鸭业带来了冲击 [2] 。本文就目前DTMUV 生物学特征、病理学、检测方法、基因组分析以及疫苗等方面的研究进展进行了如下综述,以期为 DTMUV 的进一步研究及鸭坦布苏病毒感染的预防控制提供帮助。

1、病毒生物学特征

DTMUV 属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群。DTMUV 具有黄病毒典型的形态特征,病毒粒子呈小球形,直径为 45~55nm,有囊膜,囊膜内为对称的 20 面体的核衣壳蛋白。DT-MUV 主要在感染细胞的胞浆内复制,病毒不耐热,56℃加热 15min 可灭活 [3] 。病毒对酸敏感,最佳培养为 pH7~8,酸度过高会造成病毒滴度下降,碱性较强时(pH>11)可破坏病毒囊膜从而使病毒失活。DTMUV 对氯仿、乙醚和去氧酸钠敏感 [4] 。区别于常规黄病毒的血凝性,DTMUV 并不能凝集鸡、鸭、鹅和鸽的红细胞。

DTMUV 可在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞和 Vero 细胞中增殖。鸭胚较鸡胚更易增殖该病毒,经尿囊腔接种鸭胚,通常在盲传 1~2 代后,病毒可在接种后 3~5 天导致鸭胚出现死亡。死亡鸭胚表现为绒毛尿囊膜增厚,胚体出血、水肿 [5] 。Tang 等发现病毒在接种鸭胚成纤维细胞后 48h 出现细胞病变,接种 Vero 细胞后 50h 出现细胞病变 [6] 。利用细胞分毒时需注意,病毒需要经过适应才能在细胞上产生细胞病变。

2、临床症状

产蛋鸭主要临床表现为产蛋下降,鸭采食量下降至正常值的 40%~50%,并伴随产蛋量的急剧下降,在发病后 1~2 周内,产蛋量可降至 10%~20%,以至废绝。病鸭体温升高,精神沉郁,排白绿色稀粪。雏鸭、育成鸭病鸭瘫痪,头部震颤,腹泻,严重病例因采食困难衰竭死亡 [7,8]

3、病理变化

产蛋鸭主要病理变化为卵巢出血,卵泡变形,卵黄囊膜出血,严重病例可见卵泡破裂,形成卵黄性腹膜炎。因此,该病在 2010 年发生时,曾被国内学者称为“鸭出血性卵巢炎”。除此之外,其他脏器病变如肝脏肿大,脾脏肿大、出血,腺胃出血,胰腺出血水肿,肠黏膜出血、脱落。雏鸭和育成鸭主要病理变化表现为脑水肿,脑膜可见弥散性出血点,肝脏呈土黄色,肺脏、腺胃和肾脏有不同程度病变。

4、检测方法

4.1 病原分离鉴定

采集病鸭的卵泡膜、肝脏和脾脏等病变组织样品,匀浆制成 20%悬液,上清经过 0.22μm孔径滤器过滤除菌后,经尿囊腔接种 9 日龄鸭胚。鸭胚盲传 3 代鸭胚死亡或将收获尿囊液接种 DEF 细胞或 Vero 细胞培养产生细胞病变,可分离到 DTMUV [3] 。病原分离鉴定是检测DTMUV 经典、准确的方法,但由于病原分离周期较长,该方法并不适用于临床快速检测。

4.2 病原分子生物学检测方法

自鸭坦布苏病毒感染暴发以来,科研工作者对 DTMUV 分离株测序,根据获得的基因序列信息,建立了多种针对 DTMUV 的分子生物检测方法,主要分为 RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR 和 RT-LAMP [9,10]

张帅等建立的 DTMUV 的一步法 RT-PCR检测方法,经验证该方法特异性、敏感性较高,可以检出 1.82 个 TCID 50 的病毒核酸 [11] 。王永娟等根据 DTMUV E 基因设计特异性引物,使用该方法对疑似临床样品进行检测,检出率达到100%,说明所建立的 RT-PCR 方法可以用于临床快速检测 [12] 。李国平设计引物建立的 RT-PCR方法,可以准确检测出极低含量的 DTMUV,检测下限达到 1ng RNA [13] ,而祖立闯等将一步法RT-PCR 检测方法的灵敏度进一步提高到3.78pg RNA 水平 [14] 。颜丕熙等根据 DTMUV E 基因设计里 2 对重叠引物 P1、P2 和 P3、P4 建立了套式 RT-PCR 检测方法,经验证,该套式RT-PCR 方法比一般 RT-PCR 方法敏感性高10 倍 [15]

于春梅等利用 SYBR Green I 荧光定量技术,建立了基于坦布苏病毒 NS5、E 基因的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 检测方法,为检测DTMUV 提供了一种新的特异、灵敏的方法 [16] 。刘青涛等根据DTMUV NS2A 基因的保守序列,设计并合成了一对特异性引物并建立了一步法 SYBRGreen I 荧光定量 RT-PCR 检测方法,该方法对人工感染鸭泄殖腔棉拭子的检测阳性率为 100%,比常规RT-PCR 方法高 29% [17] 。万春和等根据 DTMUVNS5 基因保守序列,建立的基于 SYBR Green I方法的荧光定量 RT-PCR 方法,从样本处理到报告结果仅需 4 h,具有较高的应用价值 [18] 。除以上方法外,张伟等、吴植等还建立了可肉眼判读,操作更为简便的采用环介导等温扩增技术的 RT-LAMP 检测方法,经验证该方法同样具有良好的敏感性,由于该方法可以使用显色剂对扩增产物进行可视化判定,所以其在基层检测一线的推广和应用价值较高 [19-21]

4.3 抗体检测方法

抗体检测可以了解鸭群 DTMUV 感染情况,目前 ELISA 是最常用的抗体检测方法。姬希文等利用纯化的 DTMUV 奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测 DTMUV 血清抗体的间接 ELISA 检测方法,经优化后,抗原最适包被浓度为 1.675μg/ 孔,血清最佳稀释度为 1∶200,阴阳性临界值判定标准为 0.432,具有较高的敏感性和特异性 [22] 。傅秋玲等优化后的抗原包被浓度为 1.548mg/L,血清最佳稀释度为 1∶100,经验证,特异性良好,未与其他鸭源病毒产生交叉反应 [23] 。孙敏华等通过表达 DTMUV NS1蛋白,在其确定的最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为 0.467 [24]

杨国平利用 DTMUV E 蛋白单克隆抗体A12D3 为金标抗体,制备鼠抗 E 蛋白多克隆抗体为包被抗体,建立了双抗体夹心胶体金试纸条检测 DTMUV 的方法,使用其所制备的胶体金试纸条检测 DTMUV,在 10~15min 即可读取结果,鉴定结果与采用 RT-PCR 检测结果符合度为 93.8%,证明该方法可用于坦布苏病的临床快速检测 [25]

5、病毒基因组

DTMUV 为单股正链 RNA 病毒,基因组全长为 10 990 个碱基。基因组由 5’端和 3’端各一个非编码区和中间的开放阅读框组成,其中5’端有帽子结构,3’端无 Poly(A)尾。整个开放阅读框编码一个多聚蛋白前体,它在病毒丝氨酸蛋白酶和宿主信号肽酶的作用下被水解为 3种结构蛋白(核衣壳蛋白 C、囊膜蛋白 E 和膜蛋白前体 prM)和 7 种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)[26] 。其中,C 蛋白能与病毒 RNA 组成核衣壳颗粒,参与病毒组装;E 蛋白是主要结构蛋白,参与病毒组装,促进病毒与宿主细胞的融合,诱导中和抗体的产生;prM 蛋白后期经水解形成 M 蛋白,M 蛋白主要参与病毒囊膜的构成;NS1 蛋白为主要抗原,能够诱导宿主产生非中和抗体;NS2A 蛋白主要促进 NS1 蛋白功能的发挥;NS2B 蛋白和NS3 蛋白共同构成一种蛋白酶复合物,该复合物完成对大部分非结构蛋白前体的切割和加工;对 NS4A、NS4B 蛋白的功能研究尚不明确,目前初步研究认为二者能够影响病毒的复制、转录;NS5 蛋白主要参与病毒基因组的复制,NS5 蛋白是 DTMUV 最保守的蛋白。

选取近 5 年 GenBank 数据库收录的 24 株DTMUV 分离株全基因组序列进行进化分析,病毒名称及 GenBank 登录号分别 为 JS-S2-2015 株 (KY810819.1)、DTMUV/CH/2014 株(KP096415.1)、DTMUV-AH2011 株(KJ958533.1)、TMUV-JS06 株 (KR869106.1)、TMUV- SH001 株 (KP742476.1)、TMUV-SDHS 株(KF826767.1)、JS201502 株(KY623441.1)、FX2010株 (KY623434.1)、HZ-2014 株(KX686580.1)、D1921/1/1/MY 株 (KX097990.1)、PS 株(KT876991.1)、SDLC 株 (KJ740747.1)、CQW1 株(KM233707.1)、AH-F10 株 (KM102539)、GX2013C 株(KP861859.1)、SX1 株(KM066945.1)、AHQY 株(KJ740748.1)、SDXT 株(KJ740745.1)、SDSG 株(KJ740746.1)、Du/CH/LSD/110128 P90株 (KJ782380.1)、SDMS 株 (KC333867.1)、JS2010 株(JX273153.1)和 BYD1 株(JQ920420.1)。通过遗传进化分析结果分析,D1921/1/3/MY 分离株与其他 23 株亲缘关系较远,处于一独立分支;其他 23 株分离株分为两大分支,两大分支下又各有亲缘关系相近的分离株处在同一小分支,该结果可以说明 DTMUV 不同地区分离株存在一定的变异情况。

6、疫苗研究进展

6.1 弱毒疫苗

张欣采用分离自山东某鸭场的一株 DT-MUV,通过 SPF 鸡胚和 SPF 鸭胚交替传代致弱获得 SDS-70 的传代毒株,经过免疫效果比对和免疫效力评价,结果表明该传代毒株具有良好的免疫原性 [27]

6.2 灭活疫苗

万春和等采用 DTMUV WR 株制备油乳剂灭活疫苗,以油乳剂疫苗 1mL/ 只注射经检测体内无 TMUV 抗体的健康开产麻鸭,免疫 21 天后每只鸭肌肉注射 1mL WR 株 DTMUV,结果显示免疫组平均产蛋率高于实验组 82.2%,所研制的油乳剂灭活疫苗对鸭坦布苏病毒具有良好的免疫保护效果。高旭元等利用 DTMUV 弱毒株 FX2010-180P 株,制备了鸭坦布苏病毒p- 丙内酯灭活疫苗,免疫 21 周龄母鸭并在免疫后第 3 周攻毒,试验结果表明免疫鸭群能够获得 100%的保护 [28] 。李振华等从产蛋下降病鸭中分离到一株 DTMUV 并制备灭活油乳疫苗,免疫保护实验结果显示,注射 0.5~0.8 mL 的灭活疫苗,免疫保护率可达到 100%,表明其制备的鸭坦布苏病毒灭活疫苗能够有效诱导免疫反应 [29]

在联合免疫方面,也有学者开展了相关研究,如刘晓文研制了鸭坦布苏病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌三联疫苗,攻毒实验结果显示,免疫后可以对鸭大肠杆菌病和鸭疫里默氏杆菌产生 100%的保护效果,对鸭坦布苏病毒有较好的免疫效果 [30] 。另外,在免疫佐剂对灭活疫苗免疫效果的影响方面,张聪等研究发现重组免疫融合肽 Tα1-BP5 能够增强鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫作用 [31]

6.3 活疫苗

齐鲁动物保健品有限公司使用 DTMUVWF100 株研制的鸭坦布苏病毒感染活疫苗已于 2016 年 6 月获批生产上市。中国农科院上海兽医研究所研制鸭坦布苏病毒活疫苗于 2014年获农业部批准进行临床试验,为该疫苗申请新兽药证书迈出关键的一步。疫苗产品的获批上市为有效防制鸭坦布苏病毒感染带来曙光。

6.4 基因工程疫苗

曲俊姿将扩增自 TMUV 山东分离株 SD/02的 prM/E 基因转入真核表达载体 pVAX1 质粒,构建 pVAX1-prM/E-CpG 重组质粒,经脂质体法包被后成功获得 DNA 疫苗 pVAX1-prM/E-CpG。经动物实验,接种 DNA 疫苗的实验组抗体水平明显高于对照组,与 TMUV 灭活疫苗对比,DNA 疫苗免疫后攻毒保护率较灭活疫苗高42.8% [32] 。马腾菲等通过体外构建 pet28a-E 重组质粒,诱导表达纯化得到浓缩 E 蛋白,采用逆相蒸发法制备成脂质体包被的鸭坦布苏病毒 E蛋白疫苗,选用樱桃谷 1 日龄雏鸭对免疫效果评价 ,结果表明,在 1 日龄、7 日龄各免疫 1 次该疫苗可获得良好的免疫效果。徐大伟等采用pCAGGS 载体构建了重组质粒 pCAGGS-E,实验表明,编码 E 基因的重组质粒 DNA 免疫小鼠后能够诱导有效的免疫应答 [33]

6.5 卵黄抗体

卵黄抗体在治疗病毒性疾病方面,具有成本低廉、免疫效果好和性质稳定的优点,具有良好的发展前景。在鸭坦布苏病毒感染的防控上,抗鸭坦布苏病毒感染的卵黄抗体研究已经取得一定进展。胡紫霞等以 DTMUV AH-F10 株制备灭活免疫制剂,通过免疫健康高产蛋鸡,获得高效价卵黄(卵黄抗体效价>1∶32),动物实验结果表明其对鸭坦布苏病毒具有明显的防治效果[34] 。赵瑞宏等制备的卵黄抗体其中和抗体效价可达 1∶447,经实验证明对 DTMUV 有明显的保护作用,能够有效保护雏鸭和产蛋鸭 [35]

7、展望

鸭坦布苏病毒感染自发病以来,给我国鸭养殖业造成了巨大经济损失,目前其危害依然持续存在。经过近几年我国研究人员的努力,有关坦布苏病毒传播方式、生物学特征、流行特点及坦布苏疫苗的研制已经取得了一些进展,但是诸如坦布苏病毒致病关键位点、安全疫苗以及人禽风险等方面的研究尚未取得实质性突破,还需继续对 DTMUV 的深入研究。建立和强化鸭场的生物安全措施是防控该病的有效措施,包括加强饲养管理,避免各种因素对鸭群的刺激,注意鸭舍定期消毒,同时,应尽量实行密闭饲养模式,以避免蚊虫、野鸟与鸭群的接触,切断传播途径。完善的鸭场生物安全措施能够较大限度地预防该病的发生,应用快速诊断方法对该病及时确诊能够减少疫病发生造成的经济损失。从“防重于治”的原则出发,研发建立系统完善的防控预警机制,对鸭坦布苏病毒感染的防控及降低其对公共卫生的威胁具有重要意义。

参考文献

[1] 孙晓艳. 不同日龄肉鸭对坦布苏病毒的易感性研究 [D]. 山东农业大学, 2014.

[2] 刁有祥. 坦布苏病毒感染研究进展[C]. 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集, 中国北京, F, 2012.

[3] 唐熠. 坦布苏病毒的分离鉴定及重组腺病毒介导 shRNA 抑制坦布苏病毒在体外复制的研究 [D]. 山东农业大学, 2013.

[4] 王贝贝, 邓守全, 马德慧, 等. 禽坦布苏病毒的研究进展 [J]. 中国生物制品学杂志, 2018,(01): 87-92.

[5] 葛平萍, 刁有祥, 唐熠, 等. 鸭坦布苏病毒山东株的分离鉴定及其特性 [J]. 中国兽医学报,2014, (01): 30-3+44.

[6] TANG Y, DIAO Y, CHEN H, et al. Isolation and Genetic Characterization of a Tembusu Virus Strain Isolated From Mosquitoes in Shandong, Chi-na [J]. Transboundary & Emerging Diseases, 2015,62(2): 209-16.

[7] 路云建. 坦布苏病毒对樱桃谷育成鸭的致病性研究 [D]. 山东农业大学, 2016.

[8] 张英. 坦布苏病毒在种鸭中垂直传播及其对种鸭的致病性研究 [D]. 山东农业大学, 2015.

[9]TANG Y, YEH Y T, CHEN H, et al. Comparison of four molecular assays for the detection of Tem-busu virus [J]. Avian Pathology Journal of the Wv-pa, 2015, 44(5): 379-85.

[10]田浪, 冯晓声, 郭吉余,等. 鸭坦布苏病毒分子生物学诊断技术研究进展 [J]. 甘肃畜牧兽医,2015, (09): 4-7.

[11]张帅, 云涛, 叶伟成,等. 鸭坦布苏病毒一步法 RT-PCR 检测方法的建立和应用 [J]. 浙江农业学报, 2012, (01): 37-40.

[12]王永娟, 董亚青, 郭方超,等. 鸭坦布苏病毒RT-PCR 检测方法的建立 [J]. 黑龙江畜牧兽医,2017, (10): 105-7.

[13]李国平. 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 诊断方法的建立与应用 [J]. 中国畜牧兽医, 2013, (01):69-72.

[14]祖立闯, 李娇, 高鹏,等. 鸭坦布苏病毒一步RT-PCR 检测方法的建立与初步应用 [J]. 广东畜牧兽医科技, 2015, (05): 37-40.

[15] 颜丕熙, 李国新, 吴晓刚, 等. 应用套式RT-PCR 快速检测鸭坦布苏病毒 [J]. 中国动物传染病学报, 2011, (03): 34-7.

[16]于春梅, 刁有祥, 唐熠,等. 坦布苏病毒荧光定量 RT-PCR 方法的建立 [J]. 中国农业科学,2012, (21): 4492-500.

[17] 刘青涛, 李银, 赵冬敏, 等. 一步法 SYBR Green 实时定量 RT-PCR 检测坦布苏病毒方法的建立 [J]. 江苏农业学报, 2015, (04): 829-33.

[18]万春和, 陈翠腾, 傅秋玲,等. 禽坦布苏病毒TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2016,(08): 49-54.

[19]张伟, 逯茂洋, 黄庆华,等. 荧光显色技术在鸭坦布苏病毒 LAMP 检测方法中的应用及比较[J]. 中国兽医科学, 2014, (04): 406-11.

[20]吴植, 夏文龙, 蔡树东,等. 鸭坦布苏病毒可视化 RT-LAMP 快速检测方法的建立与初步应用 [J]. 中国畜牧兽医, 2017, (11): 3334-9.

[21]YI T, HAO C, DIAO Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse tran-scription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and spe-cific detection of Tembusu virus [J]. Sci Rep, 2016,6(27605.

[22] 姬希文, 闫丽萍, 颜丕熙,等. 鸭坦布苏病毒抗体间接 ELISA 检测方法的建立 [J]. 中国预防兽医学报, 2011, (08): 630-4.

[23] 傅秋玲, 陈珍, 施少华,等. 鸭坦布苏病毒 E蛋白包被抗原间接 ELISA 方法的建立 [C]. 福建省畜牧兽医学会 2015 年学术年会, 中国福建厦门, F, 2015.

[24] 孙敏华, 郭建伟, 李林林, 等. 检测鸭坦布苏病毒 NS1 蛋白抗体 ELISA 方法的建立 [C]. 第25 届广东省科技进步活动月畜牧兽医学术与科技创新发展大会, 中国广东广州, F, 2016.

[25] 杨国平. 坦布苏病毒 NS5 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及快速检测胶体金试纸条方法的建立 [D]. 山东农业大学, 2015.

[26] TANG Y, DIAO Y, GAO X, et al. Analysis of the Complete Genome of Tembusu Virus, a Fla-vivirus Isolated from Ducks in China [J]. Trans-boundary & Emerging Diseases, 2012, 59 (4):336-43.

[27] 张欣. 坦布苏病毒 SDS-70 株弱毒苗的制备及安全性与免疫效力的初步评价 [D]. 山东农业大学, 2017.

[28] 高旭元. 鸭坦布苏病毒感染灭活疫苗的研制 [D]. 山西农业大学, 2014.

[29] 李振华, 李小康, 郭香玲, 等. 鸭坦布苏病毒灭活油乳苗的制备及免疫效力测定 [J]. 中国预防兽医学报, 2013, (05): 388-91.

[30] 刘晓文. 鸭坦布苏病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌三联苗的研制[D]. 华南农业大学,2016.

[31] 张聪, 张巫凡, 周江飞, 等. 重组免疫融合肽Tα1-BP5 对鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫增强作用 [J]. 中国兽医科学, 2017,(08): 945-50.

[32] 曲俊姿. 坦布苏病毒山东株 SD/02 的分离鉴定、DNA 疫苗的构建及其免疫效果 [D]. 山东农业大学, 2013.

[33] 徐大伟, 李国新, 李雪松, 等. 鸭坦布苏病毒E 基因 DNA 疫苗构建及免疫原性的初步研究[J]. 中国预防兽医学报, 2012, (04): 305-8.

[34] 胡紫霞, 王汉清, 王立, 等. 抗鸭坦布苏病毒感染卵黄抗体的制备及应用试验 [J]. 中国动物检疫, 2013, (07): 49-51.

[35] 赵瑞宏, 张丹俊, 潘孝成, 等. 抗鸭坦布苏病毒卵黄抗体的制备及检测 [J]. 养禽与禽病防治,2014, (01): 12-4.

作者:李敏1,王鸿志2,杨晶2,唐熠2#1. 广州市华南农大生物药品有限公司,广州 510000;2.山东农业大学,山东泰安 271018

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31602047);国家自然科学基金面上项目
(31472199);国家重点研发计划(2016YFD0500107-2)
通讯作者:唐熠,E-mail:tyck288@163.com

责任编辑:曹伟胜

人已赞赏
前沿综述

鸡卡氏住白细胞虫病疫苗研究进展

2019-10-24 18:04:58

前沿综述

微生态制剂异军突起走俏畜禽养殖业

2019-10-27 17:11:17

0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索