广东地区小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定分析

本研究利用鹅胚从广东地区一鹅场送检的病死鹅病料中分离到一株小鹅瘟病毒,命名为 ZJF,对其进行动物回归,发现是一株强毒。对该毒株进行了全基因序列克隆测定,拼接后获得了 ZJF 株的全基因序列,ZJF 株序列全长为 5 046 bp。其中 VP1 基因与安徽 2011 年分离株 Yan-1 核苷酸、氨基酸同源性最高为99.7%、99.3%,进化树显示处于同一小分支中,具有相同的进化祖先;与广东地区分离株GDaGPV 核苷酸、氨基酸同源性相对较低,为94.5%、97.4%,进化关系也相对较远。另外 ZJF与 GDaGPV 相比在 ITR 区有两处 14 bp 碱基的缺失。研究结果进一步完善了我国广东地区小鹅瘟的流行病学信息。

鹅细小病毒病又称小鹅瘟,是由鹅细小病毒( Goose parvovirus,GPV)引起的雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性传染病,造成肠栓塞、纤维素性肠炎及神经症状等,具有高发病率和死亡率 [1] ,严重制约着水禽业的发展。

GPV 基因组为单链线性 DNA,5 106 bp。其基因组由左右两个开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)和两端的末端重复序列(Invertedterminal repeats, ITR)组成 [2] 。分析 GenBank 上各水禽细小病毒基因组序列发现,在两个 ORF 之间间隔 18bp,左侧 ORF 编码 NS1 和 NS2 两个非结构蛋白。右侧编码区编码结构蛋白,GPV共编码 3 个结构蛋白(VP1、VP2 和 VP3),VP2和 VP3 是病毒的主要衣壳蛋白,GPV 主要抗原决定簇分布在其中 [3]

本实验室近几年一直在对鹅细小病毒进行流行监控,2016 年广东地区一鹅场 7 日龄的雏鹅发病死亡率高达 70%,剖检发现雏鹅的肠道有栓塞现象,胰腺有白点,肝脏肿大等疑似小鹅瘟的症状。实验室采集发病雏鹅的肠、肝脏、胰腺等进行了病毒的分离鉴定,确诊为小鹅瘟,并对分离株进行了全基因序列的测定分析,以了解广东地区流行 GPV 的基因特征,又为疫苗株的选用及疾病的防治提供可靠的依据。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

广东地区某鹅场。

1.1.2 鸭胚

购自广东地区某孵化场。

1.1.3 实验动物

购自佛山某鸭场(母源抗体较低)。

1.1.4 质粒、菌株

克隆载体 pMD18-T、Top10 感受态细胞为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.5 试剂及耗材

胰蛋白胨、酵母提取物为 OXOID 公司产品;0.22 μm 无菌滤器为 Millipore 公司产品;琼脂糖为北京百奥康生物技术有限公司产品;Gold view I 型核酸染色剂、DNA marker DL2000、DL5000,Premix TaqTM (EX TaqTM Version 2.0plus dye)、LA Taq 聚合酶 、Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)试剂盒均为 Takara 公司产品;AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品,胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 细胞培养液为 GIBCO 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料的处理及病毒在鹅胚上复制

将采取疑似发病鹅的肝脏、小肠等组织器官研磨,加入适量的双抗溶液,反复冻融 3 次,6 000 r/min 离心 10 min,4℃静置 4 h,然后通过尿囊腔接种法接种 12 日龄鸭胚,每胚 0.2 mL,置于 37℃孵化箱孵化,每天照胚,弃去 48 h 内死亡的胚。收集 48 h 后死亡的鸭胚尿囊液,同时观察胚体变化,并用此尿囊液在 12 日龄番鸭胚上盲传 3 代。收集尿囊液,于 -80℃保存。

1.2.2 病毒在 GEF 细胞上的复制

首先参照 2010 年版兽药典制备鸡胚成纤维细胞 SOP 标准进行 GEF 细胞的制备,使每毫升约含 1×106 个细胞,将细胞铺到 6 孔板中,每孔 2 mL,24h 生长至单层后,接种上述尿囊液,在 37℃、5% CO2 培养箱中孵育 1h 后,用 PBS洗 3 遍,加入含 2%FBS DMEM 培养基,置于37℃、5%CO2 培养箱中培养 96 h,每天观察细胞病变,在出现 80%细胞病变或 96 h 后,收集细胞及上清,于 -80℃保存。

1.2.3 小鹅瘟特异性 PCR 检测

小鹅瘟特异性检测引物参照孟繁兴 [4] ,引物序列为 GPVF:F:5,-CCAAGCTACAACAACCA-CATCTAC-3,R:5,-CTGCGGCAGGGCATAGA-CATCCGAC-3,将收取的尿囊液和细胞液按照AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量提取试剂盒说明书进行操作,参照 Premix TaqTM(LATaqTM Version2.0 plus dye)试剂盒说明书进行PCR 扩增。体系为 Primer Taq:10 滋L,上游引物:1 滋L,下游引物:0.1 滋L,ddH 2 0:6 滋L,模板:2 滋L。PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增:94℃预变性 4 min;94℃变性 30s,55 ℃退火 30 s,72℃延伸 40 s / 40s,共进行 30 个循环;72℃终延伸 10 min。

1.2.4 病毒动物回归

将上述收集到的致死鹅胚的尿囊液,取0.2 mL 10 4.0 EID 50 /0.2 mL 的病毒经肌肉注射 7 日龄无母源抗体的番鸭。攻毒后逐日观察并记录小鸭的精神状态、饮食、饮水情况,发病和病死情况。

1.2.5 细小病毒总 DNA 的提取

按照 AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 全基因引物的设计与合成

引物设计参照在 GenBank 上载的 GPV B株、GPV 06-0329 株和 MDPV GX5 株序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列如表 1 所示。

1.2.7 PCR 扩增

参照 Premix TaqTM (LA TaqTM Version2.0plus dye)试剂盒说明书进行 PCR 扩增。体系为PrimerTaq:20 滋L,上游引物:2 滋L,下游引物:2 滋L,ddH 2 0:12 滋L, 模板:4 滋L。PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增:94℃预变性 4 min;94℃变性 30 s,55 ℃退火 30 s,72℃延伸 40 s /2min,共进行 32 个循环;72℃终延伸 10 min。扩增 ITR 区和中间编码区过程中,72℃延伸的时间分别定为 40 s 和 2 min。用 1 %琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切下目的条带。

1.2.8 PCR 扩增产物的回收和纯化

使用 Axygen 凝胶回收试剂盒进行 PCR 产物的回收与纯化,按说明书操作进行。

1.2.9 PCR 纯化产物与载体连接

连接反应参照 TaKaRa 公司 pMD18-TVector 使用说明进行 。连接反应体系为pMD18-T Vector:1 滋L,Solution I:5 滋L,PCR 产物:4 滋L,混匀离心后,于 16℃连接过夜。连接产物直接用于下一步转化实验。

1.2.10 连接产物转化感受态细胞

将感受态细胞从 -80℃中取出,融化后取50 滋L,加入上述的连接产物 5 滋L,轻轻混匀,冰上放置 30 min;于 42℃热休克 90 s 后迅速冰浴 10 min;加入 200 滋L LB 液体培养基,于 37℃摇床中以160 r/min 振摇培养 60 min;将慢摇后菌液均匀涂布于已预热的 LA 固体培养基中,待菌液被平板吸收后,将平板放在 37 ℃温箱中倒置培养 12~16 h。

1.2.11 阳性菌落的筛选和鉴定

从上述平板中挑取 5~10 个单克隆菌落,分开接种于 1 mL 含 LA 液体培养基中,37℃,220 r/min 振摇培养 4 h。直接用上述菌液作为PCR 模板进行菌液 PCR 鉴定,鉴定阳性的,每个基因片段选择 3 个经 PCR 检测为阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.12 序列拼接与分析

测序结果用 DNAStar 分析软件中的 Seq-Man 进行拼接、整理,利用 MegAlign 进行列的比对分析,利用 MEGA 7.0 进行进化树的构建。

2、结果与分析

2.1 病毒分离

2.1.1 病毒在鹅胚上的分离

可引起第一代培养物在第六天左右出现死亡,取出胚体,可见胚体颈部四肢皮肤均有充血出血,肝脏轻度出血(见图 1)。

2.1.2 病毒在 GEF 上的分离

尿囊液接种 GEF 细胞,盲传 3 代,在第 4天左右细胞出现变圆,皱缩,折光度增强,最后细胞脱落细胞间隙增大(图 2)。

2.1.3 PCR 鉴定

PCR 扩增病毒基因,得到的条带与预期条带大小 375 bp 相似。

2.1.4 动物回归试验结果

第二天开始发病,第三天出现死亡;前期发病严重,第二周后症状开始减轻,到第三周病鸭基本恢复正常;病鸭出现断毛、精神沉郁、脚软喜卧;病死鸭剖检发现肝脏肿大出血,胰腺发白出血,十二指肠糜烂,卵黄蒂附近肠段严重肠栓塞,肠出血(见图 3)。

2.2 分离株全基因序列的测定分析

应用序列分析软件 DNAStarLasergene 7.1中的 SeqMan 对测序结果进行拼接,各毒株基因组片段具体信息如表 2 所示。

2.2.1 全基因序列同源性分析

ZJF 分离株序列全长为 5 046 bp,与江淮地区报道的鹅源 LH 株的基因全长相同,同源性也最高为 98.6%,与欧洲标准 B 株全基因同源性为 98.5%,相比在末端重复序列有碱基的缺失。与 GPV 疫苗株 GDaGPV、SYG61v 同源性较低,为 93.8%、93.9%。与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株同源性为 94.9%、95%。与番鸭细小病毒病代表株 MDPV-P1 株及 SAAS-SHNH 株同源性最低,为 81.4%,86.1%。

2.2.2 ITR 区序列分析

ZJF 分离株与 Genebank 已经发表的 11 株小鹅瘟的 ITR 序列进行比对分析,ITR 结构的同源性在 92.3%~99.3%之间,与江淮地区的LH 株、SHFX1201 株同源性最高,为 99.3%,基因片段长度一致。与欧洲标准 B 株同源性为98.1%,与其相比在 ITR 区 67~80bp(CACGT-GTTTCCGGT)及 333~347 bp(AGCATGTGAC-CGGA)处有碱基缺失。与 GDaGPV、SYG61v 株同源性为 93.0%、92.3%,也存在 67~80 bp(CACGTGTTTCCGGT)及 333~347bp(AGCAT-GTGACCGGA)处缺失。进化树显示 ZJF 株与RC16 重庆分离株、江淮地区 LH 分离株等处于同一小分支,与 GDaGPV、SYG61v 株(GPV 弱毒苗致弱前毒株)进化关系稍远,处于不同的小分支中,进化树见图 4。

2.2.3 NS 基因序列分析

ZJF分离株 NS 基因全长为 1 884 bp,编码627 个氨基酸,与 Genebank 上已发表的 11 株GPV 的非结构蛋白 NS 相比,其核苷酸同源性在 93.5%~99.2%,氨基酸同源性在 96.7%~99%。其中 ZJF 株与江淮地区分离株 LH、SHFX1201 株、YZ 株氨基酸同源性最高,为99%,与欧洲标准株氨基酸同源性为 98.9%,与GDaGPV 株、SYG61v 株氨基酸同源性稍低,为97%、97.6%,与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603株核苷酸同源性分别为 95.9%、95.7%。进化树显示 ZJF 株处于经典 GPV 分支,与江淮地区分离株 LH、SHFX1201 等处于同一小分支,与GDaGPV、SYG61v 株(GPV 弱毒苗致弱前毒株)进化关系稍远,处于不同的小分支中,进化树分析见图 5。

2.2.4 VP1 基因

ZJF分离株的结构基因 VP1 全长为2 199bp,无任何核苷酸的缺失或插入,编码 732个氨基酸,与 Genebank 上已发表的 12 株 GPV分离株相比,核苷酸同源性为 94.5%~99.7%,氨基酸同源性为 97.3%~99.3%。与江淮地区Yan-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高,为 99.7%(99.3%)。与江淮地区 LH、SHFX1201 株等分离株核苷酸、氨基酸同源性在 97.3%~97.9%(98.2%~99.3%)。与欧洲标准株 Virulent B 株核苷酸、氨基酸同源性为 97.5%(98%)。与GDaGPV、SYG61v 株核苷酸、氨基酸同源性较低,分别为 94.5%、94.7%(97.4%、97.8%)。与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株核苷酸、氨基酸同源性分别为 95.2%、95.3%(97.3%、97.4%)。分析显示,ZJF 分离株属于 GPV 分支,在这个大分支中又分为不同的小分支,ZJF 分离株与安徽Yan1 分离株属于同一小分支,江淮地区以 LH、SHFX1201 株为代表的分离株处于一个小分支,欧洲标准株 Virulent B 株处于一个小分支,GDaGPV、SYG61v 株处于一个小分支中,番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株处于同一小分支中,提示小鹅瘟的 VP1 基因存在抗原的多样性,VP1 进化树见图 6。

3、讨论

对华南地区一鹅场送检的病料进行常规处理后,通过鹅胚、鹅胚成纤维细胞进行病毒分离、PCR 方法进行病毒鉴定结果分离到一株小鹅瘟毒株,命名为 ZJF 株。经过全基因序列的测定分析,ZJF 分离株序列全长为 5 046 bp,与江淮地区报道的 LH、SHFX1201 等基因全长基本相同,同源性也最高,为 98.2%~98.6%,与广东地区早期 GDaGPV 分离株同源性较低,为93.8%,与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株同

源性为 94.9%、95%,与番鸭细小病毒病代表株MDPV-P1 株及 SAAS-SHNH 株同源性最低,为81.4%、86.1%。ZJF ITR 分离株区全长与江淮地区 LH 株、SHFX1201 株相同,为 414bp,相较于欧洲标准株 Virulent B 株、GDaGPV 有碱基的缺失,有报道称 ITR 的长短与病毒的毒力有关,短的毒力为强毒株,长的为弱毒株,与本研究 ZJF分离株为强毒株相符合 [5]

ZJF 分离株 ITR 结构、NS 基因、VP1 基因进化树显示多样性,ITR 结构、NS 基因进化树分析表明 ZJF 株与重庆分离株 RC-16、江淮地区分离株 LH、SHFX1201 株等处于同一小分支中,进化关系较近。VP1 基因进化树表明,ZJF株与安徽 2011 年的 Yan-1 分离株处于同一小分支中,进化关系最近,与 LH 等株进化关系相对稍远。ZJF 分离株与广东 1978 年分离的GDaGPV 的进化关系相对较远,有可能是由于广东地区小鹅瘟毒株一直在持续地进化,也有可能与本地雏鹅苗不足,大量外购外地鹅苗,导致新的小鹅瘟毒株的引入。

国内对于水禽 GPV 全基因测序研究相对较少,导致 GPV 病毒基因分型较混乱,所以对GPV 病毒进行全基因序列的测定分析是十分有必要的。

参考文献

[1]Schettler C H. Isolation of a highly pathogenic virus from geese with hepatitis [J]. Avian Diseases,1971,15(2):323-325.

[2] 贺亦龙. 5 株水禽细小病毒基因组的克隆与遗传进化分析[D]. 东北农业大学, 2014.

[3] Tatar-Kis T, Mato T, Markos B, et al.Phyloge-netic analysis of Hungarian goose parvovirus iso-lates and vaccine strains [J]. Avian Pathology,2004,33(4):438-444.

[4]孟繁兴,董浩,胡振林,等. 鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析[J].中国兽医杂志,2015,12(51):33-35.

[5] 吕亚楠等.小鹅瘟病毒 PCR 检测方法的建立及江淮地区小鹅瘟病毒分子流行病学调查[D].扬州大学, 2014.

作者:刘佳佳1,2 ,苏晓娜1,王占新1,2,覃健萍1,2,曾凡桂1,2,严专强1,2,鲁俊鹏 1,2*(1.广东温氏食品集团股份有限公司,广东新兴 527439;2.广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室,广东新兴 527439;)

责任编辑:曹伟胜

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