检测新城疫病毒荧光定量PCR引物的综合评估

为了筛选出最优的实时荧光定量 PCR (Quantitative Re-al-time PCR, qRT-PCR)引物用于检测新城疫病毒,本研究选择了 5对公开发表的(A、B、C、D 和 E)qRT-PCR 引物进行广谱性、特异性和灵敏性比对实验。结果显示:引物 A 广谱性最好,引物 B 对基因Ⅻ型的毒株扩增效果较差,而引物 C、D、E 对 Class Ⅰ毒株扩增效果较差;5 对引物对 AIV 毒株和 IBV 毒株均无扩增效果,特异性均较好;引物 C 的灵敏性最好。本研究可为新城疫的净化检测提供参考。

新城疫(Newcastle Disease,ND)是一种高度接触性、急性败血性传染病,在世界各地流行,可造成呼吸道和消化道黏膜出血,给养禽业造成巨大的经济损失,被世界动物卫生组织归为法定报告动物传染病。其病原是新城疫病毒(Newcastle Disease virus,NDV),隶属于副粘病毒科、禽副粘病毒属 [1] 。该病主要通过呼吸道和消化道进行传播,并且传播速度快。临床症状包括体温升高、食欲减退、呼吸困难、下痢、倒提病禽时有大量酸臭液体从口中流出、母鸡不产蛋或产鸡蛋壳软等症状,个别病禽会发生急性死亡。为了防制新城疫,现今我国规定强制性免疫 ND 疫苗作为预防 ND 发生的措施。疫苗的使用,使动物机体 ND 抗体水平整体较高,ND 暴发受到有效控制。但仍时有非典型 ND 感染案例发生,且不断有从野鸟体内分离到 NDV 的报道。

根据国家动物疫病中长期防治规划,至 2020 年全国所有种鸡场达到净化标准,因此,建立高效快速合理的 NDV 检测方法具有重要作用。随着传统与新型的新城疫检测方法的不断发展,现有的检测方法越来越多样化 [2] ,如病毒的分离与鉴定、血清学检测(血清中和、酶联免疫、胶体金免疫层析技术等[3] 、分子生物学诊断技术、RT-PCR、qRT-PCR、单克隆抗体、指纹图谱等应用 [4]

虽然检测 NDV 的方法层出不穷,却没有一套有效的、公认的标准化流程,各种检测方法自身也存在较多不统一的问题。qRT-PCR 的出现较大地简化了定量检测的过程,其反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强及结果清晰,因而在流行病学调查中被广泛应用。且随着qRT-PCR 应用越来越广泛,研究成果越来越丰富,用于检测 NDV 的qRT-PCR 引物也越来越多,但是扩增效果参差不齐,这方面到目前为止也没有一个好的评价标准。

因而本研究选取 5 对公开发表的用于检测 NDV 的 qRT-PCR 引物,分别对 17 株毒株的 RNA 进行荧光定量试验,比较这 5 对引物的广谱性以及特异性。再选取 5 株扩增效果好的且具有代表性的 NDV毒株对 5 对引物分别进行灵敏性试验,力求筛选出广谱性好、特异性强且灵敏性高的引物,为之后 NDV 的流行病学调查工作提供参考。

1、材料与方法

1.1 材料

13 株 NDV 病毒株、3 株 AIV 病毒株和 1 株病 IBV 病毒株由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存(表 1);9~11 日龄鸡胚由广东大华农动物保健品股份有限公司提供;总 RNA 提取试剂盒 RNA fast200(220011)为上海飞捷生物技术有限公司产品;PCR-96-AB-C 和荧光定量 PCR 用高透明封板膜为美国 Axygen 公司产品;HiScriptⅡOneStep qRT-PCR SYBR Green Kit 为南京诺唯赞生物科技有限公司产品;BIO-RAD CFX96 TM Re-al-Time System 由华南农业大学兽医学院传染病教研室提供;引物分别命名为 A、B、C、D 和E。

1.2 实验设计

1.2.1 广谱性试验

将 13 株 NDV 病毒株用总 RNA 提取试剂盒 RNA fast 200(220011)分别提取 RNA,将所提取的 RNA 分装好置于 -80℃冻存备用。根据HiScriptⅡOne Step qrt-PCR SYBR Green Kit 说明书,采用推荐的 20 滋L 体系,以这 13 株 NDV的 RNA 为模板进行荧光定量扩增反应,验证 5对引物的广谱性。同一对引物的每个模板均设置 3 个批内重复,并且每对引物均设置空白对照。在间隔 15 天和 30 天之后,在同一反应条件下分别进行第 2 次和第 3 次独立的批间重复试验。

1.2.2 特异性试验

同 1.2 实验设计中 1.2.1 的方法,以 3 株AIV 和 1 株 IBV 的 RNA 为模板,鉴定 5 对引物的特异性。

1.2.3 灵敏性试验

在广谱性试验和特异性试验的基础上,选取 5 株扩增效果较好的,且具有代表性的 NDV病毒株,分别为 PPMV-2、E-105、LaSota、GM 和F48E9。并以此为模板,对 5 对引物的灵敏性进行鉴定。先进行鸡胚半数感染量(EID 50 )的测定。将病毒尿囊液用灭菌 PBS 作 10 倍连续稀释至 10 -10 ,然后从 10 -4 开始,每个稀释度的病毒稀释液接种 5 枚 9~10 日龄鸡胚,0.1 mL/ 枚,置37℃孵育 72 h,24h 内死胚为非特异性死亡,废弃不计。72 h 后将所有鸡胚置于 4℃冻存过夜后收获各胚的绒毛尿囊并分别测定其 HA 效价,以 HA 效价为 3log2 以上判定为鸡胚发生感染,并按 Reed-Muench 法计算出 EID 50 。之后将该 5 株病毒株进行 10 倍倍比稀释,将稀释的尿囊液分别抽提 RNA,将所提取的 RNA 分装好置于 -80℃冻存备用。同 1.2 实验设计中 1.2.1的方法,以所含病毒滴度不同的 RNA 为模板,比较 5 对引物的灵敏性差异。

2、结果

2.1 广谱性试验

以 13 株 NDV 为模板,进行 qRT-PCR,结果显示,引物 C、D、E 对 97GZL 和 E83 2 株病毒株进行扩增时的 Ct 值较高且溶解曲线出现双峰现象;除此之外其他组均有扩增曲线和完整的溶解曲线(表 2)。

2.2 特异性试验

以 3 株 AIV 和 1 株 IBV 为模板,进行qRT-PCR,均无扩增曲线和完整的溶解曲线(表3)。

2.3 灵敏性试验

测得病毒株 PPMV-2、E-105、LaSota、GM和 F48E9 的 EID 50 分别为 10 5.83 、10 7.38 、10 7.83 、10 7.36和 10 7.32 ,以 5 株毒株的病毒稀释液 RNA 为模板,进行 qRT-PCR 扩增,记录 Ct 值。结果如表4 所示,在用引物 B、D、E 对病毒株 GM 的 RNA进行扩增时,只有病毒原液的 RNA 有明显的扩增曲线,稀释液的 RNA 均无法进行扩增,这 3对引物对该毒株的 qRT-PCR 扩增灵敏性较差。比较引物 A 和引物 C,综合可见,5 对引物中灵敏性相对较好的为引物 C。

2.4 结果判定

根据样品 qRT-PCR 扩增的结果来看,阴性对照样品经过 32 次循环后无 Ct 值或 Ct 较高,因此以样品有明显的扩增曲线,溶解曲线为单一峰且 Ct 值明显低于阴性对照样品的 Ct 值为阳性。

3、讨论

ND 是危害家禽养殖业较为严重的疫病之一,如仅依靠临床症状表现和病理变化,在临床上难以将其与其他禽病区分开来。目前,用于检测新城疫的方法层出不穷,如血清检测、普通PCR 和病毒分离等,但这些方法存在较多不足,耗时费力,敏感性不高。qRT-PCR 是近些年迅速发展起来的一种新型 PCR 技术,由于其特异性强、灵敏性和稳定性高,方便简易等优势,使其在众多检测方法中更胜一筹,现今也已经在检测 RNA 病毒上得到广泛的应用。由于其快速发展,科研人员设计出越来越多的引物以供检测使用,而这些引物的检测性能结果不一。本试验力求初步筛选出一对广谱性好、特异性强和灵敏性高的引物,为今后的 NDV 检测工作奠定基础。

在用 5 对引物进行 qRT-PCR 扩增后,试验结果表明,引物 A 广谱性最好。引物 B 对 NDVⅦ型病毒株进行扩增时,Ct 值较高,溶解曲线出现双峰,说明可能有非特异性扩增,对该基因型毒株特异性较差,扩增效果不佳。而引物 C、D和 E 均对 NDV Class Ⅰ病毒株没有扩增效果,广谱性较差。在特异性方面,可见该 5 对引物在对 H9N2、H5N6、H3N2 和 IBV 这几种常见的其他禽类病毒株进行 qRT-PCR 扩增时,没有出现交叉扩增,说明这 5 对引物特异性相对较高。在灵敏性方面,经过综合比较,5 对引物中灵敏性较好的为引物 C。

参考文献

[1]郑元东,李建国,王城,等.鸡新城疫流行原因及预防措施[J].当代畜禽养殖业, 2015(09):26-27.

[2]Xue C,Cong Y, Yin R, et al. Genetic diversity of the genotype VII Newcastle disease virus: identifi-cation of a novel VIIj sub-genotype. [J]. Virus Genes,2016, 53(1): 1-8.

[3]Desingu P A, Singh S D, Dhama K, et al.. A sen-sitive haemadsorption technique based RT-PCR for concentration and detection of Newcastle disease virus from clinical samples and allantoic fluid [J].Virusdisease, 2;016,27(3):319-323.

[4]冯敏莎,任涛.新城疫检测技术研究进展: 第25 届广东省科技进步活动月畜牧兽医学术与科技创新发展大会, 中国广东广州, 2016[C].

作者:陈若瑾,于得水,梁健鹏,向斌,林秋燕,徐成刚,任涛(通讯)(华南农业大学兽医学院,广州510642)

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