鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为调查分析福建和江西 2 个种鸡场产蛋率低及不合格种蛋比例高的原因,本研究通过 SPF 鸡同居感染分离到 2 株鸡传染性支气管炎病毒。对分离株 S1 基因进行测序分析显示,福建株属于 QX 基因型,江西株属于 TW 基因型。2 个分离株与目前常用疫苗株 S1 基因同源性仅为 77.1%~85.5%。

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病 [1] ,此病是严重危害养鸡业的传染病之一。2017 年 11 月至 2018 年2 月,福建漳州、江西吉安地区先后有 2 个种鸡场的产蛋鸡群出现疑似IB 症状,主要临床表现为产蛋率比正常高峰期低 4%~5%,白壳蛋、软壳蛋、沙壳蛋和畸形蛋等不合格种蛋的比例增加,无肛鸡约有 1%~2%。部分鸡只腹部较大,触诊有波动感。取死鸡或者症状较典型的病鸡进行解剖,主要表现为输卵管狭部阻塞,或形成水泡,或发育畸形等病变。

1、材料与方法

1.1 试验材料

16 日龄 SPF 鸡和 9 日龄 SPF 鸡胚由广东温氏食品集团大华农事业部 SPF 实验动物中心提供。

RaPure Viral RNA/DNA Kit、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、pMD-18 T 载体等为 TaKaRa 产品。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒分离

用 16 日龄的 SPF 鸡与该鸡群做同居感染,并每日观察。同居 10 d后,取 SPF 鸡的气管、肝和肺等组织病料剪碎,加入双抗充分研磨,反复冻融 3 次,离心取上清接种 SPF 鸡胚,37℃培养 48h,收集胚液。将同一病料接种后收获的胚液混合,继续盲传至第三代,收获 F3 代尿囊液,直接用 1%鸡红细胞悬液检测其血凝效价。

1.2.2 鸡胚发育受阻试验

取 16 枚 10 日龄大小基本一致的 SPF 鸡胚,平均分成 2 组,即试验组和对照组。试验组通过尿囊腔接种 0.2 mL F3 代病毒的胚液,对照组接种 0.2 mL 无菌生理盐水,37℃培养 6 d,期间记录鸡胚死亡情况,6天后取出胚体观察结果。

1.2.3 病毒 RT-PCR 鉴定

按 RaPure Viral RNA/DNA Kit 试剂盒说明书提取 F3 代尿囊液病毒总 RNA,采用 Feng 等设计的引物(S1-F:5’-AAGACTGAACAAAA-GACCGACT-3’,S1-R:5’-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3’)扩增S1 全基因引物[2] 。RT-PCR 反应体系和扩增程序参照 PrimeScript OneStep RT-PCR Kit 说明书进行。扩增产物用1.5%琼脂凝胶电泳分离后,使用凝胶成像系统分析成像。

1.2.4 S1 基因的克隆测序与分析

将 RT-PCR 产物回收纯化后连接于pMD-18 T 载体,转化至 BMTOP10 感受态细胞,PCR 鉴定为阳性的菌液送至生工生物工程(上海)有限公司测序。序列使用 DNASTAR 和MEGA 7.0 软件进行拼接和分析。

2、结果与分析

2.1 病毒分离及鸡胚发育受阻试验

F3 代胚液均无血凝性,鸡胚发育受阻试验显示试验组有侏儒胚或蜷曲胚。

2.2 RT-PCR 鉴定

福建、江西样品均扩增出大小为 1 700bp 左右的片段,与预期相符,表明鸡胚尿囊液中存在IBV。将福建分离株命名为 CK/CH/FJ/ZZ01/2017,江西分离株命名为CK/CH/JX/JA01/2018。

2.3 IBV 分离株 S1 基因同源性分析

测序结果显示 CK/CH/FJ/ZZ01/2017 和 CK/CH/JX/JA01/2018 2 个分离株 S1 基因长度分别为1 672bp 和 1 680bp。对 2个分离株及 6 个常用疫苗株的 S1 基因核苷酸序列进行同源性分析,如图1 所示。结果表明分离株CK/CH/FJ/ZZ01/ 2017 与疫苗株的 S1 基因核苷酸序列同源性在 77.1%~85.5% 之 间,分离株CK/CH/JX/JA01/ 2018 与疫苗株 S1 基因核苷酸序列同源性在 77.4%~82.4%之间,2 个分离株与疫苗株的同源性较低,表明本次分离的 2 个毒株与疫苗株的亲缘关系较远。

2.4 IBV 分离株 S1 基因遗传进化分析

将 2 个分离株与 40 个参考毒株的 S1 基因构建系统进化树,如图 2 所示 。分离 株CK/CH/FJ/ZZ01/2017 属于以 QXIBV 为代表的QX 型分支,分离株CK/CH/JX/JA01/2018 属于以 TW2575/98 为代表的 TW 型分支。而目前常用疫苗株主要为 Mass 型(W93、H120、Ma5 及H52)、LDT3 型及 4/91 型,分离株与疫苗株不是同一个基因型,未处于同一分支。

3、讨论

经了解,福建发病鸡群分别于 3 日龄、10日龄、50 日龄及 150 日龄免疫了 H120 疫苗;江西发病鸡群分别于 3 日龄、50 日龄免疫了H120 疫苗,10 日龄、150 日龄免疫了 4/91 疫苗。H120 株属于 Mass 型,4/91 株属于 4/91 型,而分离株分别属于 QX 型和 TW 型,分离株与疫苗株不是同一个基因型,未处于同一分支,且同源性较低(仅在 77.1%~85.5%之间),结合临床发病情况,推断其使用的疫苗可能未起到良好的保护作用。另外,2017 年 11 月至 2018 年 2月间,正值冬季,天气寒冷,昼夜温差大,饲养人员偏重于保温工作,忽视通风管理,造成鸡舍内空气质量较差,氨气浓度过高,可能是该病发生的诱因。

在生产实际中,有必要对发病种场所在地区进行持续的 IBV 流行病学监控,确定本场或本地区的优势流行株,选择保护率高的疫苗进行免疫接种,为大生产疫病防控及新疫苗的研发提供重要的参考依据。同时,也应加强饲养管理,做好保温,加强通风,降低饲养密度,严格消毒防疫,给鸡群提供良好的环境卫生条件;做好鸡群保健,在饲料或饮水中拌入维生素、微量元素及矿物质,减少应激,增强鸡的抵抗力。

参考文献

[1] Saif Y M.苏敬良译.禽病学[M].第 11 版.北京:中国农业出版社,2005.

[2]Feng K, Wang F, Xue Y, etal. Epidemiology and characterization of avian infectious bronchitis virus strains circulating in southern China during the pe-riod from 2013-2015.Sci Rep. 2017 Jul 26;7 (1):6576. doi:10.1038/s41598-017-06987-2.

作者:陈顺艳1,蓝赐华1,王安全1,陈金地1,严专强1,覃健萍1,陈峰12*(1 广东温氏食品集团股份有限公司,广东新兴 527400;2 华南农业大学,广州510642;)

* 通讯作者:陈峰,男,推广研究员,硕士生导师。

责任编辑:曹伟胜

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