为切实做好 2018 年动物疫病强制免疫工作，农业部组织制订了“2018 年国家动物疫病强制免疫计划”，对高致病性禽流感的免疫动物种类和区域明确要求为：对全国所有鸡、水禽（鸭、鹅）、人工饲养的鹌鹑和鸽子等，进行 H5 亚型和 H7 亚型高致病性禽流感免疫。供研究和疫苗生产用的家禽、进口国（地区）明确要求不得实施高致病性禽流感免疫的出口家禽，有关企业报省级兽医主管部门批准后，可以不实施免疫。强制免疫的疫苗为：经国家批准使用的“重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株）”（简称“H5+H7 二价灭活疫苗”），疫苗产品具体信息可在中国兽药信息网“国家兽药基础信息查询”平台“兽药产品批准文号数据”中查询。
从 2017 年秋季开始，全国家禽全面开展了“H5+H7 二价灭活疫苗”的免疫，在 2017 年秋防和 2018 年春防取得了明显的防控成效。所以，加强生物安全管理，做好疫苗的免疫，高致病性禽流感是可防可控的。
应用优质的禽流感疫苗，是防控禽流感的关键措施之一，优质禽流感疫苗应包含这些要素：制苗毒株的针对性强，抗原含量足和效价高、免后抗体水平高及免疫副反应轻等。禽流感灭活疫苗的制备过程，包括：毒种的选育、半成品病毒液的制备、病毒液的灭活和疫苗的乳化等多个环节，按照 GMP 的管理要求，每一个生产环节完成，须检验合格后才可进入下一个生产环节，通过生产全过程每个环节的质量把关，确保最终生产出来的疫苗全面符合质量标准的要求。
“永顺生物”是我国最早获批的高致病性禽流感疫苗定点生产企业之一，多年来，通过不断完善质量管理制度，有效落实 GMP 管理措施，使得禽流感灭活疫苗的质量水平在全国名列前茅。现就禽流感灭活疫苗制备过程的质量控制简述如下。
1、毒种选育与半成品制备的质量控制
1.1 毒种的筛选与繁育
“H5+H7 二价灭活疫苗”制苗用的基础毒种是哈尔滨兽医研究所（国家禽流感参考实验室）利用反向遗传操作技术构建而成的，用于构建制苗毒种的基因供体毒株是当前最具代表性的 H5 和 H7 亚型禽流感病毒株，其中 H5N1 Re-8 株针对的是 H5 亚型禽流感主要流行的基因型clade 2.3.4.4 分支；H7-Re1 株针对的是 H7N9 亚型禽流感。
由基础毒种制备生产毒种，质量控制的关键点是： （1）选用有质量保证的优质 SPF 鸡胚进行毒种复壮和繁育，确保所制备的生产毒种纯净和高效价。（2）选择最适合的毒种稀释倍数稀释毒种进行接种。（3）接种后的鸡胚控制在 36～37℃进行后孵化。（4）确保接种后的鸡胚有足够的孵育时间。（5）准确测定病毒液的 HA 效价，从中选择 HA 效价高的病毒液留作毒种。通过对这些质量关键点进行严格的把控，制备的 H5N1 Re-8株和 H7N9 H7-Re1 株生产毒种可以达到 HA 效价≥1∶512，每 0.1mL病毒含量≥108.0 EID50，为生产优质疫苗打下坚实基础。
1.2 半成品病毒液的制备
制备了生产毒种，下一个生产工序是制备大批量的半成品病毒液，这个环节质量控制的关键点是： （1）选用 H5 和H7 亚型禽流感非免疫蛋鸡所生产的新鲜、洁净、均一和无畸形的受精鸡蛋，孵化至 10～11日龄的鸡胚，用这种易感而有活力的鸡胚进行病毒培养，制备高效价的病毒液。（2）用合适的稀释倍数稀释毒种进行接种，有效提高毒种的复制效力。（3）在接种过程严格执行无菌操作程序，避免细菌污染致死鸡胚而不能进行正常的病毒培养。（4）大批量生产过程中，后孵化的鸡胚密度大，要控制后孵化的温度在 36～37℃之间。（5）确保接种后的鸡胚有足够的孵育时间。（6）在收获病毒液前，鸡胚应在 2～8℃完全冻透，血管和蛋黄收缩良好，使所收获的病毒液杂质少、收量多。通过在这些关键点实施有效的质量控制，制备的病毒液杂质少、效价高，为生产优质疫苗提供基本保障。这个环节做得好与差，所制备的半成品病病毒液有明显的质量差异，具体数据见表 1。
以上介绍了禽流感灭活疫苗制备过程中毒种的选育、半成品病毒液的制备两个生产环节的质量控制，以下为检验篇。
2、原材料生产工序与产品检验
禽流感灭活疫苗的制备过程包括毒种的选育、半成品病毒液的制备、病毒的灭活、疫苗的乳化和分装等多个环节，按兽药 GMP 的管理原则，疫苗质量是通过生产过程的质量控制来实现的，这一质量管理的指导思想是全员参与质量管理，严格执行生产操作技术规范，从原材料使用到生产每道工序每个环节都严格进行质量把关，确保疫苗的生产严格按经过验证的工艺进行，从而使最终生产出来的疫苗全面达到质量标准的要求。
在实施全面质量管理的过程中，快速而准确的检验是关键的技术支撑。对疫苗制备过程的质量控制，须严格按各生产工序的质量标准进行检验，准确地给出检验结果，才能杜绝不合格的半成品进入下一道生产工序；对疫苗成品的检验，也必须按疫苗制造与检验规程的质量标准全面进行检验，保证检验结果的真实可靠，才能确保不合格的产品不出厂。现就“H5+H7二价灭活疫苗”质量控制过程中的检验要点简述如下。
2.1 主要原材料的检验
2.1.1 非免疫受精鸡蛋的检验
每一批受精鸡蛋经检验合格才投入使用，使孵化至 10～11 日龄的鸡胚为健康易感鸡胚，从而使制备的半成品病毒液效价高、纯净性好，是保证疫苗品质优良的基础。按非免疫受精鸡蛋的质量标准，须快速准确进行检验的项目包括：（1）鸡蛋的外观洁净、均一、无畸形和无破损； （2）蛋的重量适中，在 50～70g 之间；（3）萃取蛋黄液用 H5 和 H7 亚型禽流感抗原检测 HI抗体，HI 抗体效价均应＜1:2，确保鸡蛋产自 H5和 H7 亚型禽流感疫苗非免疫蛋鸡群。
2.1.2 注射用白油的检验
“H5+H7 二价灭活疫苗”为油包水型油乳剂疫苗，选用优质的注射用白油才能保证疫苗的稳定性，提高疫苗的免疫效力和减轻疫苗的不良反应。按《中国兽药典》（2015 版）的质量标准，注射用白油的主要检验项目有：（1）性状为无色透明、无臭、无味的油状液体； （2）相对密度为 0.818～0.880；（3）稠环芳烃：其最大吸光度不得超过 0.10；（4）重金属：含重金属应不超过1×10-5；（5）铅：含铅应不超过 1×10-6；（6）砷：含砷应不超过 1×10-6 。
2.2 疫苗制备过程的半成品检验
2.2.1 生产用毒种的检验
毒种的纯净和高效价是生产高质量半成品病毒液的根本保证，对每批生产用毒种必须严格地进行系统的检验，符合要求才可用于生产。对生产用毒种的检验包括：（1）选用健康的 10日龄 SPF 鸡胚测定毒种的病毒含量，准确配制1%的鸡红细胞悬液测定毒种的 HA 效价，保证检验的准确性，确保毒种的病毒含量和 HA 效价符合质量标准；（2）按《中国兽药典》（2015版）的操作规范和标准对毒种进行纯净性检验，确保毒种无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染；（3）用微量法 HI 试验对毒种进行特异性检验，H5N1 Re-8 株毒种应只对禽流感病毒 H5亚型单特异性 抗血清为阳性反应 ，H7N9H7-Re1 株毒种应只对禽流感病毒 H7 亚型单特异性抗血清为阳性反应。
2.2.2 半成品病毒液的效价检验
准确配制 1%的鸡红细胞悬液用微量法HA 试验，对半成品病毒液抽样进行 HA 效价检验，符合质量标准才能进入下一生产环节。
2.2.3 病毒液灭活后的无菌检验
对灭活后的 H5N1 Re-8 株 和 H7N9H7-Re1 株病毒液分别抽样，按《中国兽药典》（2015 版）的操作规范和标准进行无菌检验，应无菌生长才可用于配制疫苗。
2.2.4 病毒液灭活后的灭活检验
对灭活后的 H5N1 Re-8 株 和 H7N9H7-Re1 株病毒液分别抽样，用健康的 10 日龄SPF 鸡胚，按疫苗制造与检验规程的操作规范和标准进行灭活检验，经检验确认病毒已灭活完全才能用于配制疫苗。
2.3 成品的检验
分装后的疫苗成品必须按规定留样进行全面的质量检验，根据疫苗制造与检验规程的要求，成品检验的项目包括：（1）外观为乳白色均匀乳剂；（2）剂型为油包水型；（3）疫苗的稳定性检验：取 10mL 疫苗以 3 000r/min 离心 15min，管底析出的水相应不超过 0.5mL；（4）装量检查、无菌检验、黏度及甲醛残留量测定，均要符合《中国兽药典》（2015 版）的规定；（5）在负压隔离器，按疫苗制造与检验规程的操作规范和标准进行安全检验、效力检验，均须符合规定。
疫苗、药品是用于防病治病的特殊产品，国际上对疫苗、药品质量管理的理念有一个不断变化的过程，从“质量是检验出来的”到“质量是生产出来的”，进而又到“质量是通过良好的设计而生产出来的”等。然而，不管如何变化，所有质量管理的有效实施都离不开严谨而精确的检验作为技术支撑。
作者：李永红，肖永珍（广东永顺生物制药股份有限公司，广州510640）
责任编辑：李斐
