鸽毛滴虫全虫疫苗免疫效果研究

将鸽毛滴虫体外培养扩增后,制成毛滴虫全虫灭活疫苗,免疫鸽子。鸽毛滴虫全虫疫苗能刺激机体产生抗鸽毛滴虫抗体而起到免疫保护作用,而且第二次免疫可以促进机体进一步产生抗体,使鸽群获得更好的保护率。

鸽毛滴虫病是由鸽源禽毛滴虫(以下简称鸽毛滴虫)引起的。1878 年 Rivolta 首次在欧洲鸽的小肠中发现鸽毛滴虫以来,世界各地均有该病的报道,在我国带虫率在 60%以上 [1] ,对养鸽业造成了较大的损失。体外实验证实二甲硝唑、替硝唑具有显著的杀毛滴虫作用 [2] ,但药物限制及药物残留等因素的影响,使得疫苗的研究较有必要。本试验将鸽毛滴虫体外进行人工培养扩增后,制成毛滴虫全虫灭活疫苗,然后用全虫灭活苗免疫鸽子,观察保护效果。

1、材料与方法

1.1 鸽毛滴虫全虫疫苗的制备

将鸽毛滴虫接种到鸽毛滴虫培养基,经过 3~5 天的恒温培养,无菌操作 5 000 r/min 离心 10min,弃上清,加入适量PBS(pH 7.2),超声波粉碎:工作时间 4s,间隔时间 10s,功率400W,循环 30 次;暂停破碎,冰浴 10 min,再同上条件循环30 次。超声破碎完毕后,用BiopHotometer 生物分光光度计测定蛋白含量,并稀释到100mg/mL,备用。将稀释的全虫抗原蛋白与矿物油以 1:1.5的比例于搅拌器中充分混匀,乳化为油包水乳化疫苗。

1.2 试验动物的分组与处理

48 只健康青年鸽饲养于无鸽毛滴虫的环境中,分成 3个试验组,每组 16 只鸽,每组分 4 个笼饲养,每笼 4 只鸽;48只带虫鸽分为 3 组,每组 16只,每组分 4 个笼饲养,每笼 4只鸽。其中一组健康鸽和一组带虫鸽作对照。

将试验鸽于 90 日龄时首次免疫,15 天后采血提取血清,检测抗体水平并检查鸽带虫情况,同时进行第二次免疫,15 天后再采血提取血清,检测抗体水平并检查鸽带虫情况,对所有试验鸽经口腔接种 1×10 7 个强致病性的鸽毛滴虫,连续观察 15 天。免疫情况详见表1。

1.3 试验鸽抗体的检测

以密度为 5×10 5 个 /mL的鸽毛滴虫抗原,血清按 1∶400 倍稀释,酶标二抗按 1∶500 倍稀释,用间接 ELISA 方法检测试验鸽抗鸽毛滴虫抗体水平,所得数据用 SPSS DataEditor 软件分析。

2、结果

2.1 鸽毛滴虫全虫疫苗免疫鸽的抗体水平

对照健康鸽抗体水平为0.016±0.00152,对照带虫鸽为0.023±0.00361,两者差异不显著(P>0.05),而首免全虫疫苗后 15 天,第 1、2 组健康鸽所产生的抗体水平分别为:0.029±0.00471 和 0.033±0.00424,同时免疫第 4、5 组带虫鸽所产生的抗体水平分别为 0.027±0.00450 和 0.028±0.00236。统计分析结果表明:该 4 组抗体水平差异不显著(P>0.05),与对照健康鸽的抗体水平比较,结果均差异显著(P<0.05),但与对照带虫鸽差异不显著(P>0.05)。二免后 15 天,第 1、2 组健康鸽的抗体水平分别为0.044 ±0.00753 和 0.047 ±0.00648,第 4、5 组带虫鸽的抗体水平分别为 0.040±0.00483和 0.044±0.01668。统计分析结果表明,它们之间的抗体水平差异不显著(P>0.05),与对照健康鸽和带虫鸽的抗体水平比较,结果均差异显著(P<0.05)。详见表 2。

2.2 试验鸽免疫保护效果

首免 15 天后,对照带虫鸽组死亡 4 只,注射全虫疫苗的带虫鸽各组仅死亡 1 只,所有健康鸽组未见死亡且无鸽毛滴虫感染;到二免 15 天后,对照带虫鸽再死亡 3 只,注射免疫接种物的带虫鸽组和所有健康鸽组未见死亡,健康鸽组无鸽毛滴虫感染。给试验鸽经口腔接种 1×10 7 个强致病性的鸽毛滴虫,15 天后,未进行免疫的第 7 组对照健康鸽死亡 3只,死亡率为 18.75%,未死亡鸽均已感染鸽毛滴虫;接种pcDNA6-a(+)空质粒的第 3 组健康鸽死亡 4 只,死亡率为25%,未死亡鸽也均已感染鸽毛滴虫;其他各组的健康鸽和带虫鸽均无死亡,保护率为100%,约 50%鸽子感染鸽毛滴虫,死亡情况详见表 3。

3、讨论

3.1 接种疫苗后鸽毛滴虫抗体水平变化情况的分析

以全虫疫苗免疫健康鸽和带虫鸽,彼此间的抗体水平差异不显著(P>0.05),但与对照健康鸽相比均差异显著(P<0.05)。二免后,健康鸽和带虫鸽之间的抗体水平差异仍不显著(P>0.05),但它们与对照鸽的 抗体 水 平 相 比 差 异 显 著(P<0.05),说明全虫疫苗确实能刺激机体产生抗体,而且对健康鸽和带虫鸽均有作用。将两次免疫所产生抗体水平进行比较,二免 15 天后的抗体水平都比首免 15 天后的高,说明全虫疫苗第二次免疫可以促进机体进一步产生抗体,而且对健康鸽和带虫鸽的作用都一样。可见本试验研制的鸽毛滴虫全虫疫苗能刺激鸽体产生鸽毛滴虫抗体,而且第二次免疫可以刺激机体进一步产生抗体。

3.2 试验鸽免疫保护效果分析

鸽毛滴虫的感染非常普遍,几乎所有的鸽子都是毛滴虫的带虫者,在形成足够的免疫保护力之前,受强毒虫株感染时,死亡率可高达 50% [3] ,感染鸽耐过后能抵抗强毒虫株的攻击,本次试验验证了这一现象。在试验过程中 16 只对照带虫鸽,首免 15 天后死亡 4 只,二免 15 天后又死亡 3 只,共死亡了 7 只,死亡率为 43.75%,给剩余的带虫鸽接种强致病性的鸽毛滴虫后,带虫鸽不见死亡。本次试验免疫了鸽毛滴虫全虫疫苗的健康鸽子,保护率为 100%,而未免疫疫苗的健康鸽部分不能抵抗强毒虫株而死亡,首免 15 天后,注射全虫疫苗的带虫鸽各组仅死亡 1只,所有健康鸽组未见死亡。到二免时,注射疫苗的带虫鸽组和所有健康鸽组未见死亡。给试验鸽经口腔接种 1×10 7 个强致病性的鸽毛滴虫,15 天后,未进行免疫的第 7 组对照健康鸽死亡 3 只,死亡率为18.75%,其他各组的健康鸽和带虫鸽均无死亡。试验表明研制的鸽毛滴虫全虫疫苗能刺激机体产生抗鸽毛滴虫抗体而起到免疫保护作用,且较安全。而且第二次免疫可以促进机体进一步产生抗体,使鸽群获得更好的保护率。

参考文献

[1]罗锋.广东鸽毛滴虫感染情况调查及体外培养与应用.华南农业大学硕士论文,2004.

[2]罗锋,翁亚彪,张健騑,等.鸽源禽毛滴虫的体外药敏试验 . 中国兽医科学,2006,36(12):980-982.

[3]卡尔尼克.B.W.禽病学(第十版).北京:中国农业出版社.2001,1130-1133.

作者:罗锋1、2 ,李国清 3*(1、温氏集团西南养猪分公司,四川南充 637600 2、广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室,广东云浮 527400;3、华南农业大学兽医学院,广州 5106422)

* 作者简介:罗锋(1972-),男,湖北荆门人,博士后,主要从事鸽病、猪病的研究,E-mail: luofong2009@126.com,李国清为通讯作者,研究方向为兽医寄生虫学。

责任编辑:翁亚彪

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