传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性、高度接触传染性疾病。IB 是世界动物卫生组织（OIE）及我国规定的家禽 B/ 二类传染病之一，能引起鸡群显著的呼吸和肾型临床症状，造成生产性能下降。蛋雏鸡感染 IB，除因呼吸道或肾脏感染而死亡外，还会造成生殖系统永久非可逆损伤，形成假母鸡，产蛋数量与产蛋质量明显下降 [1，2] 。有些 IBV 毒株还可以引起肠道、腺胃、肌肉的病变 [3] 。IBV 防控的难点在于血清型、基因型众多，且不同血清型、基因型之间的交叉保护力较弱，因此长期充分的流行病学调查对 IB 的防控具有重要的意义，为传染性支气管炎的免疫学研究及防控提供依据。
1、材料与方法
1.1 病料
病料采自南方某鸡场疑似感染传染性支气管炎的鸡群，且具有典型病变特征的病死鸡肾脏、肺脏组织。无菌操作采集病死鸡的肺脏、肾脏等组织。
1.2 SPF 鸡胚和 SPF 鸡
SPF 鸡胚和 SPF 鸡均为广东新兴大华农禽蛋有限公司 SPF 实验动物中心产品，SPF 鸡饲养于硬壁负压隔离器内。
1.3 病毒分离
无菌操作条件下将病料剪碎，以 1: 5 放入 pH 值为 7.4 含有青霉素 2 000U/mL、链霉素 1 000U/mL 的磷酸缓冲盐水（PBS）中充分研磨，研钵研磨后反复冻融 3 次，经 10 000r/min 离心 5 min，将上清液通过 0.22 μm 微孔滤器除菌，尿囊腔接种 10 日龄 SPF 鸡胚，接种剂量为 0.2 mL，37℃孵育。每 12h 照胚 1 次，弃去 24 h 内死胚，无菌收集 56 h 的鸡胚尿囊液再接种鸡胚，连续盲传 3 代。并通过动物回归试验、血凝试验、RT-PCR 等方法对病毒进行鉴定。将分离毒株命名为 LYG15。
1.4 分离株半数感染量（EID 50 ）测定
病毒尿囊液将病毒液按 10 -6 ～10 -3 倍比稀释，每个稀释度接种SPF 胚 5 枚，0.2mL/ 枚，同时设阳性和阴性对照。37℃孵育，弃去24h 内死胚，每天 2 次统计每个稀释度鸡胚的发病和死亡情况，直至第 7 天观察剩余鸡胚病变情况。若出现胚体卷曲、侏儒，鸡胚中肾脏有尿酸盐沉积等病变，则判断该鸡胚感染了 IBV，按Reed-Muench 二氏法计算病毒的 EID 50 。
1.5 动物实验
25 只 7 天龄 SPF 鸡分 2 组，试验组 15 只感染 LYG15 病毒株，攻毒剂量为 10 5.0 EID 50 / 只，对照组 10 只接种相应量的生理盐水，隔离器内饲养。
1.6 RNA 提取与 S1 基因获得
收集到的尿囊液，参照 Axyprep 体液病毒DNA/RNA 小量试剂盒说明书进行病毒总 RNA提取。参照 Primescript One Step RT-PCR KitVer.2 一步法反转录试剂盒说明书进行 S1 基因的扩增。S1 基因扩增引物为：F5’-AAGACT-GAACAAAAGACCGACT-3’，R5’-CAAAACCT-GCCATAACTAACATA-3’；扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行胶回收。回收产物连接pMD19-T 载体，连接产物转入 E. coli DH5α 感受态细胞，培养到一定浓度后均匀涂布于 LA平板上，37℃培养 16h。进行菌液 PCR 鉴定，结果为阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。
1.7 S1 基因遗传进化分析
测序结果经 DNAstar Lasergene 7.1 软件对LYG15 株与 GenBank 中已发表的部分参考株S1 基因序列进行分析，构建遗传进化树。
2、结果与分析
2.1 病毒分离以及 EID 50
病料研磨液接种鸡胚后，第 1 代未观明显病变，随着传代次数的增加，病变现象也越来越明显，表现为羊膜增厚，表面混浊，胚体发生蜷缩，趾爪紧抱头部，侏儒胚比例增加。EID 50 的测定结果表明，分离株的 EID 50 为 10 6.2 EID 50 /0.2mL。
2.2 血凝试验
经终浓度为 1%胰酶 37℃处理 4h 后，该病毒尿囊液可凝集鸡的红细胞，而未经处理的病毒尿囊液则无血凝活性。
2.3 动物攻毒试验
第 2 天开始发病，第 4 天出现死亡；病鸡精神沉郁，排石灰水样粪便，病死鸡剖检肾脏肿大、苍白，花斑肾（图 1），气管有少量黏液，死亡率为 66%（9/15）。
2.4 S1 基因序列核苷酸同源性分析
S1 基因扩增得到约 1 700bp 的条带，与预期目的片段大小一致。通过与 GenBank 中已发表的部分国内代表株及常用疫苗株 S1 基因序列进行比对发现，LYG15 分离株与 16 株 IBV参考株核苷酸序列相似性为 67.9%～96.2%。其中与台湾株（TW2575-98）S1 基因核苷酸相似性最高，为 96.2%；与国内常用的疫苗株类型基因对比发现，与 Mass 型、QX 基因型、4/91 型和LDT3 型等相似性为 80.7%～82.4%。
2.5 遗传进化树分析
通过 Lasergene 7.0 软件，将 LYG15 分离株S1 基因序列与 GenBank 中发布的部分国内代表株及常用疫苗株 S1 基因核苷酸序列进行遗传进化分析，可见 LYG15 株与 16 株参考株分为 6 个群，LYG15 株与台湾型分离株位于同一进化分支，该分支毒株在系统进化树上属于国内近年来流行株，与国内常用的 H 120 代表的Mass 型疫苗株、4/91 型疫苗株、QX 型疫苗株的亲缘关系较远（图 2）。
3、讨论
本研究从临床发病的鸡群肾脏组织中分离到 1 株病毒，经过鸡胚接种试验、动物攻毒试验、血凝试验及 RT-PCR 等鉴定，证实 LYG15分离株为 IBV。该毒株鸡胚尿囊液本身无血凝活性，但经 1%胰酶处理后有血凝活性。
基因型是建立在病毒基因序列或结构差异的基础上的一种分型方法，国内外多数研究者以变异性高、编码重要的结构功能蛋白 S1 蛋白的 S1 基因作为研究对象 [4] 。TW 型 IBV 中的参考毒株最早分离自我国台湾地区，近几年大陆地区 TW I 型分离株报道逐渐增多，主要引起病征为肾脏肿大，肾炎病变，称为肾炎型。目前国内使用的疫苗主要是 Mass 型、4/91 型和 QX 型疫苗株，与本实验分离得到的毒株在系统进化树上相差较远。且近年来国内的一些研究发现，国内流行毒株变异在加快，常用的疫苗株只能保护部分毒株侵染，大量的分离株与其遗传关系较远 [5] 。由于不同血清型之间交叉免疫保护能力差 [6] ，因此 Mass 型、QX 型等疫苗的大量使用产生的疫苗选择压可能造成交叉保护力弱的TW I 型毒株的相对增多。目前对大陆地区 TWI 型毒株的研究较少，需要引起注意并进一步研究。
参考文献
[1] 刘胜旺. 我国鸡传染性支气管炎流行现状及原因分析[J]. 中国家禽, 2010(16):5-9.
[2] 尤永君. 鸡传染性支气管炎病毒疫苗候选毒株的筛选及评价[D]. 中国农业大学, 2015.
[3]Gelb J J, Weisman Y, Ladman B S, et al. S1 gene characteristics and efficacy of vaccination against infectious bronchitis virus field isolates from the U-nited States and Israel (1996 to 2000) [J]. Avian Pathol, 2005, 34 (3):194-203.
[4]Cavanagh D, Davis P J, Cook J K A, et al. Loca-tion of the amino acid differences in the S1 spike glycoprotein subunit of closely related serotypes of infectious bronchitis virus. [J]. Avian Pathol, 1992,21 (1):33-43.
[5]Ji J, Xie J, Chen F, Shu D, et al. Phylogenetic distribution and predominant genotype of the avian infectious bronchitis virus in China during 2008-2009 [J]. Virol J, 2011, 8 (1):184.
[6]Lee EK, Jeon WJ, Lee YJ, et al. Genetic diversity of avian infectious bronchitis virus isolates in Korea between 2003 and 2006 [J]. Avian Dis, 2008, 52:332-337.
作者：李鸿鑫1,2，封柯宇1,2，谢青梅1,2*(1华南农业大学动物科学学院，广州510642 2广东省畜禽健康养殖与安全生产重点实验室，广州510642)
* 通讯作者：谢青梅，女，博士生导师，E-mail：qmx@scau.edu.cn
责任编辑：曹伟胜
