1株台湾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与初步鉴定

本试验通过动物攻毒试验、血凝试验和 RT-PCR 等方法,从南方某鸡场分离了 1 株台湾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为 LYG15 株。LYG15 株的 S1 基因核苷酸序列与 TW2575-98 分离株相似性达 96.2%,与 Mass 型等疫苗株的亲缘关系较远,能引发肾型临床症状。

传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性、高度接触传染性疾病。IB 是世界动物卫生组织(OIE)及我国规定的家禽 B/ 二类传染病之一,能引起鸡群显著的呼吸和肾型临床症状,造成生产性能下降。蛋雏鸡感染 IB,除因呼吸道或肾脏感染而死亡外,还会造成生殖系统永久非可逆损伤,形成假母鸡,产蛋数量与产蛋质量明显下降 [1,2] 。有些 IBV 毒株还可以引起肠道、腺胃、肌肉的病变 [3] 。IBV 防控的难点在于血清型、基因型众多,且不同血清型、基因型之间的交叉保护力较弱,因此长期充分的流行病学调查对 IB 的防控具有重要的意义,为传染性支气管炎的免疫学研究及防控提供依据。

1、材料与方法

1.1 病料

病料采自南方某鸡场疑似感染传染性支气管炎的鸡群,且具有典型病变特征的病死鸡肾脏、肺脏组织。无菌操作采集病死鸡的肺脏、肾脏等组织。

1.2 SPF 鸡胚和 SPF 鸡

SPF 鸡胚和 SPF 鸡均为广东新兴大华农禽蛋有限公司 SPF 实验动物中心产品,SPF 鸡饲养于硬壁负压隔离器内。

1.3 病毒分离

无菌操作条件下将病料剪碎,以 1: 5 放入 pH 值为 7.4 含有青霉素 2 000U/mL、链霉素 1 000U/mL 的磷酸缓冲盐水(PBS)中充分研磨,研钵研磨后反复冻融 3 次,经 10 000r/min 离心 5 min,将上清液通过 0.22 μm 微孔滤器除菌,尿囊腔接种 10 日龄 SPF 鸡胚,接种剂量为 0.2 mL,37℃孵育。每 12h 照胚 1 次,弃去 24 h 内死胚,无菌收集 56 h 的鸡胚尿囊液再接种鸡胚,连续盲传 3 代。并通过动物回归试验、血凝试验、RT-PCR 等方法对病毒进行鉴定。将分离毒株命名为 LYG15。

1.4 分离株半数感染量(EID 50 )测定

病毒尿囊液将病毒液按 10 -6 ~10 -3 倍比稀释,每个稀释度接种SPF 胚 5 枚,0.2mL/ 枚,同时设阳性和阴性对照。37℃孵育,弃去24h 内死胚,每天 2 次统计每个稀释度鸡胚的发病和死亡情况,直至第 7 天观察剩余鸡胚病变情况。若出现胚体卷曲、侏儒,鸡胚中肾脏有尿酸盐沉积等病变,则判断该鸡胚感染了 IBV,按Reed-Muench 二氏法计算病毒的 EID 50

1.5 动物实验

25 只 7 天龄 SPF 鸡分 2 组,试验组 15 只感染 LYG15 病毒株,攻毒剂量为 10 5.0 EID 50 / 只,对照组 10 只接种相应量的生理盐水,隔离器内饲养。

1.6 RNA 提取与 S1 基因获得

收集到的尿囊液,参照 Axyprep 体液病毒DNA/RNA 小量试剂盒说明书进行病毒总 RNA提取。参照 Primescript One Step RT-PCR KitVer.2 一步法反转录试剂盒说明书进行 S1 基因的扩增。S1 基因扩增引物为:F5’-AAGACT-GAACAAAAGACCGACT-3’,R5’-CAAAACCT-GCCATAACTAACATA-3’;扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测,并进行胶回收。回收产物连接pMD19-T 载体,连接产物转入 E. coli DH5α 感受态细胞,培养到一定浓度后均匀涂布于 LA平板上,37℃培养 16h。进行菌液 PCR 鉴定,结果为阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.7 S1 基因遗传进化分析

测序结果经 DNAstar Lasergene 7.1 软件对LYG15 株与 GenBank 中已发表的部分参考株S1 基因序列进行分析,构建遗传进化树。

2、结果与分析

2.1 病毒分离以及 EID 50

病料研磨液接种鸡胚后,第 1 代未观明显病变,随着传代次数的增加,病变现象也越来越明显,表现为羊膜增厚,表面混浊,胚体发生蜷缩,趾爪紧抱头部,侏儒胚比例增加。EID 50 的测定结果表明,分离株的 EID 50 为 10 6.2 EID 50 /0.2mL。

2.2 血凝试验

经终浓度为 1%胰酶 37℃处理 4h 后,该病毒尿囊液可凝集鸡的红细胞,而未经处理的病毒尿囊液则无血凝活性。

2.3 动物攻毒试验

第 2 天开始发病,第 4 天出现死亡;病鸡精神沉郁,排石灰水样粪便,病死鸡剖检肾脏肿大、苍白,花斑肾(图 1),气管有少量黏液,死亡率为 66%(9/15)。

2.4 S1 基因序列核苷酸同源性分析

S1 基因扩增得到约 1 700bp 的条带,与预期目的片段大小一致。通过与 GenBank 中已发表的部分国内代表株及常用疫苗株 S1 基因序列进行比对发现,LYG15 分离株与 16 株 IBV参考株核苷酸序列相似性为 67.9%~96.2%。其中与台湾株(TW2575-98)S1 基因核苷酸相似性最高,为 96.2%;与国内常用的疫苗株类型基因对比发现,与 Mass 型、QX 基因型、4/91 型和LDT3 型等相似性为 80.7%~82.4%。

2.5 遗传进化树分析

通过 Lasergene 7.0 软件,将 LYG15 分离株S1 基因序列与 GenBank 中发布的部分国内代表株及常用疫苗株 S1 基因核苷酸序列进行遗传进化分析,可见 LYG15 株与 16 株参考株分为 6 个群,LYG15 株与台湾型分离株位于同一进化分支,该分支毒株在系统进化树上属于国内近年来流行株,与国内常用的 H 120 代表的Mass 型疫苗株、4/91 型疫苗株、QX 型疫苗株的亲缘关系较远(图 2)。

3、讨论

本研究从临床发病的鸡群肾脏组织中分离到 1 株病毒,经过鸡胚接种试验、动物攻毒试验、血凝试验及 RT-PCR 等鉴定,证实 LYG15分离株为 IBV。该毒株鸡胚尿囊液本身无血凝活性,但经 1%胰酶处理后有血凝活性。

基因型是建立在病毒基因序列或结构差异的基础上的一种分型方法,国内外多数研究者以变异性高、编码重要的结构功能蛋白 S1 蛋白的 S1 基因作为研究对象 [4] 。TW 型 IBV 中的参考毒株最早分离自我国台湾地区,近几年大陆地区 TW I 型分离株报道逐渐增多,主要引起病征为肾脏肿大,肾炎病变,称为肾炎型。目前国内使用的疫苗主要是 Mass 型、4/91 型和 QX 型疫苗株,与本实验分离得到的毒株在系统进化树上相差较远。且近年来国内的一些研究发现,国内流行毒株变异在加快,常用的疫苗株只能保护部分毒株侵染,大量的分离株与其遗传关系较远 [5] 。由于不同血清型之间交叉免疫保护能力差 [6] ,因此 Mass 型、QX 型等疫苗的大量使用产生的疫苗选择压可能造成交叉保护力弱的TW I 型毒株的相对增多。目前对大陆地区 TWI 型毒株的研究较少,需要引起注意并进一步研究。

参考文献

[1] 刘胜旺. 我国鸡传染性支气管炎流行现状及原因分析[J]. 中国家禽, 2010(16):5-9.

[2] 尤永君. 鸡传染性支气管炎病毒疫苗候选毒株的筛选及评价[D]. 中国农业大学, 2015.

[3]Gelb J J, Weisman Y, Ladman B S, et al. S1 gene characteristics and efficacy of vaccination against infectious bronchitis virus field isolates from the U-nited States and Israel (1996 to 2000) [J]. Avian Pathol, 2005, 34 (3):194-203.

[4]Cavanagh D, Davis P J, Cook J K A, et al. Loca-tion of the amino acid differences in the S1 spike glycoprotein subunit of closely related serotypes of infectious bronchitis virus. [J]. Avian Pathol, 1992,21 (1):33-43.

[5]Ji J, Xie J, Chen F, Shu D, et al. Phylogenetic distribution and predominant genotype of the avian infectious bronchitis virus in China during 2008-2009 [J]. Virol J, 2011, 8 (1):184.

[6]Lee EK, Jeon WJ, Lee YJ, et al. Genetic diversity of avian infectious bronchitis virus isolates in Korea between 2003 and 2006 [J]. Avian Dis, 2008, 52:332-337.

作者:李鸿鑫1,2,封柯宇1,2,谢青梅1,2*(1华南农业大学动物科学学院,广州510642 2广东省畜禽健康养殖与安全生产重点实验室,广州510642)

* 通讯作者:谢青梅,女,博士生导师,E-mail:qmx@scau.edu.cn

责任编辑:曹伟胜

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