禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）引起的通过种蛋垂直传播的肿瘤性疾病，是目前危害我国养禽业发展的重要疫病之一 [1-2] 。该病已在全球许多国家发生和流行，早期 ALV-A、ALV-B 是引起鸡群淋巴性白血病和各类型肿瘤的主要亚群，自 1999 年杜岩等首次在我国肉鸡中检出 ALV-J 后，相继在蛋鸡和地方品系鸡中发现 ALV-J 的流行 [3-7] 。本课题组利用 2 年时间对河南省地方品种鸡 ALV 的感染情况进行调查，结果发现 ALV-J 和 ALV-ALB 同时感染非常普遍，且临床肿瘤类型和病理变化呈多样化，ALV 与网状内皮增生症病毒( REV )的共感染现象也较多见 [8] 。
AL 目前尚无疫苗可供使用，其预防控制主要依赖种群的净化措施。目前国际上普遍被采用的 AL 净化金标准 [9] 为：核心群分别在 68、168 日龄采取血浆，接种 DF- 1 细胞，9 天后检测 ALV-p27 抗原，淘汰阳性鸡；对保留核心群种鸡的下一代所有刚出壳的雏鸡，检测其胎粪中的 ALV-p27 抗原，淘汰阳性鸡的所有家系成员，如此反复 4～5 个世代，直至达到净化。但我国大多数地方品种鸡场的规模和经济实力不够大，无力承受该净化程序的成本和代价。另外采用国际金标准净化要求的技术条件、人力成本、试剂成本及实验室仪器条件等都比较高。本研究以河南省某地方品种鸡为研究对象，先采取 ELISA 方法检测 ALV-p27 抗原，连续多代淘汰阳性鸡，将种群阳性率降低到一定水平以下，然后再接种 DF-1细胞进行病毒分离，以达到进一步净化的目的。
1、材料与方法
1.1 试验动物
来源于河南省某地方品种鸡场。
1.2 主要检测仪器和试剂
二氧化碳培养箱（Thermo 公司）、倒置显微镜、生物安全柜、酶标仪（Thermo 公司）、微量加样器、ALV- p27 抗原检测试剂盒（为 BioChek 公司产品）、ALV-A/B 和ALV-J 抗体检测试剂盒（为 IDEXX 公司产品）、DMEM 培养液（为 GIBCO 公司产品）、新生牛血清（为 GIBCO 公司产品）、胰酶、DF-1 细胞等。
1.3 检测方法
1.3.1 泄殖腔棉拭子 ALV-p27 抗原检测
采样前在样品管中加入 1mL 样品稀释液，用无菌棉签采集试验鸡泄殖腔棉拭子，与稀释液混匀后冷冻。反复冻融 2 次，检测前将样品恢复至 25℃，按照 BioChek 公司 ELISA 试剂盒的操作说明进行检测。
1.3.2 血清 ALV 特异性抗体的检测
采集试验鸡促凝血，4 000r/min 离心 10min分离血清，用稀释液将血清作 1:500 稀释，按照IDEXX 公司 ELISA 试剂盒的操作说明检测ALV-J 亚型及 ALV-A/B 亚型抗体。
1.3.3 病毒的分离
无菌操作采集试验鸡抗凝血，接种于已长成单层的 DF-1 细胞，37℃ 继续孵育 2h，弃上清液，更换为含有 1% 新生牛血清的 DMEM 培养液，在 37℃、5%CO 2 条件下继续培养 9 天。然后冷冻，反复冻融 2 次后，取细胞培养液用ELISA 试剂盒检测 ALV-p27 抗原。
1.4 净化程序和管理
1.4.1 核心鸡群禽白血病感染情况调查
为了解鸡群 ALV 的感染程度和感染类型，采集配套母系及父系核心群 163～170 日龄种鸡，每只鸡都戴好脚号，对号采集泄殖腔棉拭子，按照 BioChek 公司 ELISA 试剂盒的操作说明检测 ALV-p27 抗原并做好详细记录。抽样采集对应的血清和全血样品，血清按 IDEXX 公司ELISA 检测试剂盒的操作说明检测 ALV-J 和ALV-A/B 抗体，以确定鸡群白血病感染类型。全血样品进行 ALV 分离。
1.4.2 阴性鸡群的选留
淘汰第 1 世代 ALV-p27 抗原阳性鸡，剩下的阴性鸡只转入经过彻底消毒后的种鸡舍内，采用单笼饲养。
1.4.3 阴性鸡群的饲养管理
选择技术熟练并能独立完成本舍饲养管理工作的饲养人员，要求不得串舍、不参与其他鸡舍的工作。本鸡舍内的所有用具都要做好标记，不与其他鸡舍混用并定期消毒。鸡舍每 2 天用聚维酮碘或百毒杀溶液带鸡消毒 1 次，鸡舍周围每 2 天用 2%~4%氢氧化钠喷洒消毒 1 次。由专人负责人工授精工作，授精时要用一次性的输精枪头，每输完 1 次精后要洗手消毒，防止交叉感染。
1.4.4 阴性鸡群种蛋孵化管理
收留阴性鸡所产的种蛋进行孵化并做好详细记录。种蛋库在进种蛋前先用次氯酸钠进行喷洒消毒，再用甲醛进行熏蒸消毒，并每 2 天用0.05%百毒杀喷雾消毒 1 次。设专人单独挑选和码放种蛋，工作前先用 0.1%新洁尔灭洗手消毒。蛋车、蛋盘、孵化机和出雏机专用，用前应彻底冲洗干净，并用 0.05%百毒杀喷洒和甲醛熏蒸消毒。孵化室每 3 天用次氯酸钠喷洒消毒地面 1 次。出雏时用纸袋封装每只母鸡所产的种蛋并做好编号。雌雄鉴别由指定专人进行。出雏免疫时的针头要分开使用。
1.4.5 第 2 世代及以后各世代阴性鸡群的选留
出雏当天收集 1 日龄雏鸡胎粪进行ALV-p27 抗原检测。所有样品需要在出雏后24 h 内检测结束，若检测鸡结果为阳性，其家系应立即全部淘汰。检测结果为阴性者再接种马立克氏病疫苗。8 周龄抽样检测鸡群泄殖腔ALV-p27 抗原，淘汰阳性鸡只。23 周龄逐只检测泄殖腔 ALV-p27 抗原，淘汰阳性鸡。抽样进行 ALV-J、ALV-A/B 抗体检测及 ALV 分离。
2、结果与分析
2.1 第 1 世代核心种鸡群 ALV 感染情况
对核心鸡群的 1 256 只鸡，分别采集泄殖腔棉拭子，采用 ELISA 方法检测 ALV-p27 抗原，结果显示抗原阳性率为 20.06%（252/1 256）。随机采取 92 只鸡的血清，采用 ELISA检测样品中 ALV-A/B 和 ALV-J 抗体，结果显示 ALV-A/B 和 ALV-J 抗体阳性率分别为27.17%（25/92）、17.39%（16/92）， 某些个体ALV-A/B 和 ALV-J 抗体均为阳性。随机采取46 只鸡的全血，进行 ALV 分离鉴定，结果显示ALV 分离阳性率为 13.04%（6/46）。试验结果说明，该核心鸡群 ALV 感染较严重，并且存在ALV-A/B 和 ALV-J 2 种或 3 种亚群同时感染可能。第 1 世代核心种鸡群检测结果见表 1。
2.2 第 2 世代鸡群 ALV 感染检测结果
2.2.1 第 2 世代雏鸡胎粪检测结果
出雏当天收集胎粪进行 ALV- p27 抗原检测，共检测雏鸡 2 936 只，其中抗原阳性鸡 30只，阳性率为 1.02%，检测结果见表 2。淘汰胎粪检测阳性个体所属家系，阴性家系个体集中隔离饲养。
2.2.2 第 2 世代鸡群 8 周龄 ALV 检测结果
8 周龄时随机采取 184 只鸡泄殖腔棉拭子，采用 ELISA 方法检测 ALV-p27 抗原，抗原阳性率为 1.09%（2/184），检测结果见表 2。
2.2.3 第 2 世代鸡群 23 周龄 ALV 检测结果
23 周龄时采集 2 640 只鸡泄殖腔棉拭子，检测 ALV-p27 抗原，其中抗原阳性鸡为 125只，阳性率为 4.73%。随机采取 92 只鸡的血清，检测样品中 ALV-A/B 和 ALV-J 抗体，结果抗体阳性率分别为 5.43%（5/92）、6.52%（6/92）。随机采取 46 只鸡的全血，进行 ALV 分离鉴定，结果显示病毒分离阳性率为 2.17%（1/46）。检测结果见表 2。
2.3 鸡群净化效果
经过 2 个世代的净化淘汰，第 2 世代鸡群泄殖腔 ALV-p27 抗原、A/B 亚群抗体、J 亚群抗体和病毒分离各检测项目阳性率均明显下降。具体表现为第 2 世代鸡群 23 周龄 ALV 检测结果与第 1 世代（163～170 日龄）相比 ALV-p27抗原阳性率由 20.06%下降到 4.73%，降低15.33%；ALV-A/B 抗体阳性率由 27.17%降低到5.43%，降低 21.74%；ALV-J 抗体阳性率由17.39%降低到 6.52%，降低 10.87%；ALV 分离阳性率由 13.04%降低到 2.17%，降低 10.87%。说明该鸡群禽白血病净化取得初步成效。
3、讨论
为了尽量减少 AL 对鸡群造成的损失，对该病的净化应从原种代开始。近几年，我国在禽白血病种群净化方面取得了一定的成效 [10-11] ，有许多可借鉴之处。但是由于不同的鸡场 ALV 的感染程度、感染类型有差异，不同品种的鸡群ALV 自然感染动态有差异，因此在制订净化方案前需对核心群祖代进行 ALV 感染情况调查，通过泄殖腔棉拭子、种蛋蛋清、血清抗体及病毒分离检测种鸡的带毒情况，之后确认净化方案，这样才能确保净化效率和最终净化效果，不能一概照抄照搬。雏鸡 1 日龄检测胎粪 ALV- p27抗原，能反映上一代鸡群 AL 的净化效果，而且有资料显示 1 只鸡胎粪带毒，则可能造成同一苗箱内运输的雏鸡有 20%～30% 鸡只感染ALV，因此根据 1 日龄检测 ALV 淘汰阳性鸡是较为重要的。本实验结果显示第二世代雏鸡胎粪 ALV-p27 抗原阳性率为 1.02%，说明第一世代鸡群净化效果是较好的。本实验选择 8 周龄进行抽样检测泄殖腔 ALV-p27 抗原，23 周龄全群检测泄殖腔 ALV-p27 抗原，是根据我们对该地方品种鸡 ALV 自然感染动态检测结果，分析鸡群排毒规律确定的。
本实验结果显示，经过 2 个世代净化，该地方品种鸡群 23 周龄抗原阳性率下降到 4.73%，净化效果显著，说明选择的净化方案是可行的。但是随着禽白血病净化工作的继续，ALV-p27抗原阳性率下降会越来越难，因此要求在净化时一定要选择质量可靠、信誉度高、重复性好的试剂盒，严格按操作规程进行检测。同时做好活疫苗的选择，加强鸡舍的生物安全管理和孵化管理。另外，采用 ELISA 方法检测 ALV-p27 抗原，其主要缺陷是无法区分内源性 ALV 和外源性 ALV，同时还无法检测出所有的外源性 ALV[2,12] ，所以当种群 ALV-p27 抗原阳性率降低到一定水平以下，必须开展病毒的分离工作，以期实现彻底净化的目的。总之，禽白血病的净化是一个长期的、系统的工作，需要高度重视，持之以恒地坚持下去。
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作者：张桂枝、靳双星*、黄炎坤、姬向波(河南牧业经济学院动物科技学院，郑州450046)
基金项目：河南省重大科技专项计划项目（161100510200）；校科技 创新团队项目（HUAHE2015003）
作者简介：张桂枝（1970-），女，副教授，硕士，从事畜禽疫病防治的 教学与科研工作，通讯地址：郑州市郑东新区龙子湖北路 6 号河南牧业 经济学院动物科技学院，邮编 450046；E-mail: zhangguizhi666@126.com
* 通讯作者:靳双星（1970-）男，教授，硕士，从事畜禽疫病防治的教 学与科研工作，E-mail: jinshuangxing@126.com
责任编辑：曹伟胜
