禽白血病是由一类禽反转录病毒引起的鸡的肿瘤性疾病。自 20 世纪 90 年代以来，禽白血病特别是 J 亚群禽白血病病毒给我国养鸡业造成了重大的经济损失。我国养鸡业和禽病界也在防控鸡群白血病方面获得了重要的经验教训：必须高度重视鸡群的种源净化，必须对种鸡群的外源性白血病感染实施严格监控和净化 [1] 。目前，用于禽白血病净化有多种方法，采样方式也各不相同，选择合适的方法和方式进行检测较重要［2］。
本研究通过对不同收毒时间、不同采样方式和不同冻融次数的比较，摸索出了提高阳性鉴定率的方法。
1、材料与方法
1.1 试验动物
本试验所用精液、血浆及胎粪样品均来源于岭南黄鸡相关品系。
1.2 主要试剂与仪器
ALV-p27 抗原试剂盒为IDEXX 公司产品；DF-1 细胞由爱德士公司提供；胎牛血清、高糖 DMEM、胰酶、青链霉素溶液为 Gibco 公司产品；其他仪器包括 Thermo 1389 生物安全柜、Thermo 371 二氧化碳培养箱、ZEISS HBO 50/AC 倒置显微镜 、Eppendorf Centrifuge 5810R 高速冷冻离心机 、Bio-tek ELX808 酶标仪。
1.3 样品采集与处理
1.3.1 无菌抗凝血采集与处理
用肝素锂抗凝管翅静脉采血约 1.5 mL，1 500 r/min 离心 5min，取血浆接种 DF-I 细胞。
1.3.2 精液采集与处理
将公鸡精液采集于灭菌2mL 离心管中，用含青链霉素的 PBS 按 1∶3 进行稀释，震荡后 3 000 r/min 离心 3 min，取上清接种 DF-1 细胞，最终稀释浓度为 1∶30。
1.4 病毒分离
血浆样品每份取 50 滋L 接种于 24 孔细胞板中（每孔含500 滋L 10%生长液），精液样品每份取 50 滋L 上清接种于 24孔细胞板中（每孔含 450 滋L10%生长液），培养 24 h 后培养液更换为 2%维持液，培养共 9 天收样，细胞板置 -80℃中冻融 3 次后进行 p27 抗原ELISA 检测。
1.5 胎粪的采集及处理
出雏当天，采集胎粪于2mL 灭菌离心管中，用涡旋震荡器充分震碎，用液氮进行冻融。
1.6 ALV-p27 抗原 ELISA 检测
按 p27 抗原试剂盒说明书进行检测。
2、结果与分析
2.1 血浆病毒分离不同收毒时间结果比较
选择 10 份已知病毒分离阳性的血浆样品，分别接种DF1 细胞，同时接种阴性、阳性对照，分别培养 5 天、6 天、7天、8 天、9 天收毒，用 ELISA检测 p27 抗原。
从表 1 可知，1～4 号样品细胞培养第 5～9 天检测，S/P值比较稳定，都在 2.0 以上；5～8 号样品随着细胞培养时间的增加，S/P 值逐渐升高；9～10 号样品在细胞培养第 5 天检测仍为阴性，到 6～9 天才能陆续检测到阳性。因此，对于弱阳性样品，延长细胞培养时间以提高阳性鉴定率是有必要的。
2.2 公鸡血浆和精液病毒分离结果比较
对公鸡同时采集血样和精液，血浆和精液处理后分别接种到 DF-1 细胞上，同时接种已知阴性、阳性对照，培养 9 天后收毒，通过 ELISA 检测 p27抗原。
从表 2 可知，在所检的公鸡中，血浆和精液同时阳性的有 8 只；血浆阳性，精液阴性的有 3 只；血浆阴性，精液阳性的有 3 只。该结果表明，以病毒分离为标准，精液病毒分离可以检出血浆病毒分离阴性的样品，作为净化程序，一般都要尽可能淘汰阳性或疑似阳性样品，因此精液病毒分离可以作为血浆病毒分离的补充。
2.3 胎粪样品不同冻融次数结果比较
对胎粪样品分别用涡旋混合器充分震碎后每份平均分成3 份，其中 1 份不冻融，1 份冻融 1 次，1 份冻融 2 次，通过ELISA 检测 p27 抗原。
从表 3 可知，所检的样品中，冻融 2 次共检出阳性 13份，冻融 1 次共检出阳性 7 份，不冻融共检出阳性 6 份。该结果表明，胎粪不同冻融次数的阳性鉴定率从高到低依次是 2次冻融>1 次冻融 > 不冻融。因此，2 次冻融有利于提高阳性样品的鉴定率。
3、讨论
在集约化养殖场，人工输精是一种常用的技术手段，精液是禽白血病传播的一个重要渠道。禽白血病病毒污染的公鸡精液在人工输精的过程会污染母鸡的泄殖腔、产道，公鸡作为禽白血病病毒的携带者可通过接触或交配传染给其他鸡，禽白血病经种公鸡垂直传播的效应可能被放大 [3] 。在禽白血病净化中，血浆病毒分离为国际公认的金标准，通过其他的方式也可以不同程度地检出阳性样品。本研究通过对岭南黄鸡血浆与精液病毒分离结果的比较发现精液病毒分离可以检出血浆病毒分离阴性的样品，作为净化程序，一般都要尽可能淘汰阳性或疑似阳性的个体，因此，在禽白血病净化中可对公鸡同时进行血浆和精液病毒分离，做好公鸡的淘汰。
对于需要进行白血病净化的种鸡场，净化程序包括胎粪检测、病毒分离、蛋清检测等多种方法和多次检测 [4] 。从查阅的文献中，较少对血浆样品病毒分离接种 DF-1 细胞培养天数的要求和胎粪检测要求，从研究结果看，血浆样品病毒分离接种 DF-1 细胞，培养 9 天的阳性鉴定率高于 5～8 天；胎粪样品进行 2 次冻融的鉴定率高于冻融 1 次或不冻融。以上检测方法均可在一定程度上提高阳性样品的鉴定率，可为禽白血病净化工作提供技术参考。
参考文献
［1］崔治中.禽白血病[M].北京：中国农业出版社，2015.2-9.
［2］俞燕，徐步，范建华，等.种公鸡精液禽白血病病毒检测方法研究及初步应用[J].中国家禽，2015,37（22）:14-19.
［3］饶明章，袁丽霞，赵子君，等. 黄羽祖代公鸡精液作为禽白血病检测材料的应用研究[J].畜牧兽医学报，2017,48（1）：124-131.
［4］崔治中，孙淑红，赵鹏，等.对种禽场禽白血病净化方案的建议 [J]. 中国家禽，2014，36（1）：3-6.
作者：蔡曼珊1舒鼎铭1罗成龙1陆新钊2瞿浩1（1.畜禽育种国家重点实验室 & 广东省动物育种与营养公共实验室，广东省农业科学院动物科学研究所，广州 510640；2. 广东智威农业科技股份有限公司，广州 510640）
1** 通讯作者，E-mail：qhw03@163.com，基金项目：国家自然科学基金项目（31402067）、广东省自然科学基金项目（S2013030013313）、国家现代农业产业技术体系专项（nycytx-41）以及广州市科技计划项目（201504010017）。
责任编辑：曹伟胜
