泰万菌素对鸡胚中鸡滑液支原体的抑制研究

为了解泰万菌素对鸡滑液支原体(MS)垂直传播的抑制作用,我们测定泰万菌素对 MS-HB1 株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示 , 泰万菌素对 MS-HB1 株的 MIC 为0.008μg/mL。然后将 MS 接种 5 日龄 SPF 鸡胚,3 日后分别接种 10MIC 和 50MIC 泰万菌素,作用 3 日和 5 日后分别检测鸡胚中的 MS。结果泰万菌素作用 3 日对鸡胚中 MS 的抑制率分别为 30%和 41.7%,与对照组相比差异不显著(P>0.05);作用 5 日对鸡胚中 MS 的抑制率分别为 54.5%和 70%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。结果表明,泰万菌素对鸡胚中的 MS有抑制作用,且作用时间对抑制效果影响较大。

鸡滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)可引起鸡滑液囊炎,该病是鸡的一种急性或慢性传染病,以侵害关节滑液、腱鞘膜和气囊为主,其特征为关节、腱鞘和脚掌肿胀 [1] ,并使产蛋鸡产蛋量下降,蛋品质以及孵化率降低 [2] 。鸡群感染后可导致明显的跛行,生长发育迟缓及胴体降解等,并与呼吸道疾病有所关联,目前该病在鸡场中广泛流行。MS 可通过接触传播,感染的鸡接触健康鸡后,健康鸡呼吸道中能检测到MS [3] 。MS 还可以垂直传播 [4],经卵传播给子代,子代雏鸡感染之后可慢性感染并持续终生。鸡滑液支原体感染已遍布全球 [5],给养殖业带来了巨大的损失。因此,控制种鸡的感染以防止滑液支原体经卵传播是非常重要的。泰万菌素已广泛用于防治猪气喘病、猪痢疾、猪增生性肠炎和鸡支原体感染,本研究将不同浓度的泰万菌素作用于鸡胚中的 MS,以探索泰万菌素对鸡胚中MS 的抑制作用。

1、材料与方法

1.1 材料

(1)鸡滑液支原体 MS- HB1 株,由华中农业大学兽医微生物与免疫学教研室分离、鉴定与保存,浓度为 10 7.0 CCU/mL。

(2)泰万菌素,批号为 AW- 175,由浙江伊科拜克动物保健品有限公司提供。使用前进行溶解,并过滤除菌。

1.2 方法

1.2.1 MIC 测定

在 96 孔细胞板中每孔加 100 滋L FM-4 培养基。将 100 滋L 泰万菌素加入第 1 孔中,充分吹打均匀后,取 100 滋L 加入第 2 孔,依次 2 倍倍比稀释到第 10 孔,至泰万菌素的浓度分别为 2 滋g/mL、1 滋g/mL、0.5 滋g/mL、0.125 滋g/mL、0.0625 滋g/mL、0.031 滋g/mL、0.016 滋g/mL、0.008滋g/mL、0.004 滋g/mL 和 0.002 滋g/mL。将 100 滋L稀释到 10 5 CCU/mL 的 HB1 株菌液加到细胞板的 1~10 孔中,第 11 孔不加作阳性对照,第 12孔只加药物不加菌液作阴性对照。每个稀释度做两个重复。细胞板加盖密封,37℃温箱培养5~7 日,当阳性对照变为黄色,阴性对照不发生颜色变化时,未发生颜色变化的最低药物浓度为该抗菌药的 MIC。

1.2.2 接种

当 SPF 鸡胚孵化至 5 日龄时,经卵黄囊接种 10 4.0 CCU/0.1mL 的滑液支原体 HB1 株,0.1mL/ 枚。3 日后,经相同方式接种 10MIC 和50MIC 的泰万菌素,同时设置接毒对照 10 枚,只接种 MS 不接种泰万菌素;和空白对照 10枚,MS 和泰万菌素均不接种,各组均置于 37℃孵化箱进行孵化。

1.2.3 卵黄膜支原体检测

于泰万菌素接种后第 3 日和第 5 日,在实验组和对照组中各取一半鸡胚,分别抽取适量卵黄膜,接种于 5 mL 支原体液体培养基中,置温箱培养。7 日后,取卵黄膜培养物以 8 000r/min 离心 5 min,取上清 100μL,加入 900μL新鲜培养基,置 37℃温箱继续进行培养。

1.2.4 结果判定

7 日后,根据培养物颜色变化判定结果。

2、结果

2.1 MIC 测定结果

泰万菌素对 MS-HB1 株的 MIC 为0.008滋g/mL。

2.2 泰万菌素作用 3 日结果

在鸡胚接种泰万菌素后 3 日,在实验组和对照组中随机选择一半鸡胚,取卵黄膜进行 MS增殖实验,结果 A-0.4、A-0.08 和接毒对照组的变色数分别为 7 管(7/12)、7 管(7/10)和 10 管(10/10),表 明 0.08 滋g 泰 万 菌 素 对 鸡 胚 中MS-HB1 株的抑制率为 41.7%(5/12);0.4滋g 泰万菌素对鸡胚中 MS-HB1 株的抑制率为 30%(3/10),结果见表 1。用卡方检验对各组数据进行比较,泰万菌素接种组与对照相比差异不显著(P>0.05)。

2.3 泰万菌素作用 5 日结果

在鸡胚接种泰万菌素后 5 日,在实验组和对照组中随机选择一半鸡胚,取卵黄膜进行 MS增殖实验,结果 A-0.4、A-0.08 和接毒对照组的变色数分别为 3 管(3/10)、5 管(5/11)和 10 管(10/10),表明药物处理 5 日对鸡胚中 MS-HB1株的有效率分别为 70%(7/10)、54.5%(6/11)。结果见表 2。用卡方检验对各组结果进行比较,泰万菌素接种组与对照相比差异非常显著(P<0.05)。

3、讨论

MS 可经蛋传播,故从蛋抑制传播是有效的控制方式。本研究首先测定泰万菌素对鸡滑液支原体 MS-HB1 株 的 MIC。 泰万菌素对MS-HB1 株的 MIC 为0.008μg/mL。使用 10MIC和 50MIC 的泰万菌素作用 3 日对鸡胚中 MS 的抑制率分别为 41.7%和 30%,作用 5 日对鸡胚中 MS 的抑制率为 54.5%和 70%,接毒对照组抑制率均为 0。结果表明泰万菌素对鸡胚中的MS 具有抑制作用,作用 3 日,与对照组相比差异均不显著;药物作用 5 日与对照组相比差异极其显著,表明药物作用时间越长,对鸡胚中MS 的抑制作用越强。药物未能全部杀灭鸡胚中的 MS,其原因可能是受鸡胚内环境的影响,需提高用药剂量或延长药物作用时间。

药物治疗可降低经蛋传染水平。研究表明,使用泰乐菌素和庆大霉素浸蛋或注射的方法对蛋进行处理 [6] ,或加热处理 [7] 种蛋等方法可防止种禽群的 MS 经蛋传递。本研究表明,在 SPF 鸡胚感染 MS 后注射泰万菌素可抑制 MS 的增殖,但是泰万菌素的使用剂量和作用时间还需进一步研究。

参考文献

[1]丁美娟,尹秀凤,黄显明,等.鸡滑液囊支原体病研究进展[J].中国家禽,2013,35(13):39-41.

[2]Higgins, P.A.,Whithear, K.G. Detection and dif-ferentiation of Mycoplasma gallisepticum and M.synoviae antibodies in chicken serum using en-zyme-linked immunosorbent assay [J]. Avian Dis1986.30, 160-168.

[3] Landman W J,Feberwee A. Longitudinal field study on the occurrence of Mycoplasma synoviae in Dutch tyrkey flocks with lameness and experimen-tal induction of the condition [J]. Avian Pathol,2012, 41(2):141-149.

[4] Camaghan R B A.Egg transmission of infectious synovitis[J]. J Comp Pathol, 1961, 71:279-285.

[5]陆承平.兽医微生物学(第 3 版)[M].北京:中国农业出版社,2001,367-369.

[6] Nascimento, E.R., and M.G.F. Nascimento.1994. Eradication of Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae from a chicken flock in Brazil. Proc West Poult Dis Conf. 43:58-59.

[7]Yoder, H.W., Jr. Preincubation heat treatment of chicken hatching eggs to inactivate mycoplasma[J]. Avian Dis. 1970. 14:75-86.

作者:韩相敏1 ,文丽2 ,高俊锋 1 ,马晶晶 1 ,吴碧清 1 ,赖志1 ,胡思顺 *3(1. 龙阔(上海)生物工程有限公司,上海 201619,2.浙江伊科拜克动物保健品有限公司,上海 201101,3.华中农业大学,武汉 430070)

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