重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗免疫效果的评价

为了评价重组 H5 亚型禽流感病毒三价灭活疫苗的免疫效果,在 2016 年 7 月至2017 年 8 月期间,对免疫重组 H5 亚型禽流感病毒三价灭活疫苗(H5N1,Re-6 株 +Re-7 株+Re-8 株)的家禽采集了1999份血清样品,采用血凝与血凝抑制方法进行检测,结果为 H5亚 型 禽 流 感 病 毒 Re-6 株免疫合格率为86.84%,H5 亚型禽流感病毒 Re-7 株免疫合格率 71.44%,H5 亚型禽流感病毒 Re-8 株免疫合格率为 67.78%。结果表明,免疫重组 H5 亚型禽流感病毒三价灭活疫苗后,不同毒株的抗体、不同种类的家禽、不同免疫次数的抗体水平均有差异。

H5 亚型禽流感属于动物一类传染病,给我国养禽业带来严重威胁 [1] 。近年来 H5 亚型禽流感流行毒株不断发生变化,为实施针对性免疫预防,农业部于 2016 年 3 月推出 H5N1 Re-8株。随着 H5N1 Re-8 株的生产,重组禽流感病毒 H5 亚 型 三 价 灭 活 疫 苗 (H5N1,Re-6 株+Re-7 株 +Re-8 株)在家禽上的应用逐渐增加。为了解免疫重组 H5 亚型禽流感病毒三价灭活疫苗的免疫效果,在 2016 年 7 至 2017 年8 月,采集免疫重组 H5 亚型禽流感病毒三价灭活疫苗的家禽进行抗体监测,为掌握该疫苗在家禽使用效果进行评价,现将结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 家禽血清

在 2016 年 7 至 2017 年 8 月采自东莞市家禽养殖场点,均已免疫重组禽流感病毒 H5 亚型三价灭活疫苗,其中鸡血清 1 089 份,鸭血清 480 份,鹅血清 430 份。以翅静脉采血,以3 500r/min 离心 15 min 分离获得待检血清,-20℃保存备检。

1.2 试剂

1.2.1 1%鸡红细胞悬液

采集实验室饲养的 3 只禽流感和新城疫非免疫的健康公鸡的血液与阿氏液等体积混合,用 pH 值 7.2 的 0.01mol/L PBS 液洗涤 3 次,每次以 1 000r/min 离心10min,洗涤后用 PBS 液配成体积分数 1%鸡红细胞悬液,4℃保存备用。

1.2.2 H5 亚型禽流感抗原和阳性血清

H5 亚型禽流感抗原(Re-6)株、(Re-7)株、(Re-8)株及相对应毒株的阳性血清,是中国哈尔滨维科生物科技有限公司产品。

1.2.3 主要耗材和仪器

96 孔“V”型反应板,离心机,8 道移液器,微量震荡器。

1.3 方法

按照《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T18936-2003)规定的血凝与血凝抑制方法操作。以完全抑制 4 单位抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 的滴度。HI 效价小于或等于 3 1og2判阴性,HI 效价等于 4 1og2 为可疑,进行重复试验,HI 效价大于或等于 5 1og2 判阳性,判定为抗体合格。根据东莞市动物疫病监测方案规定,家禽免疫后 21 天进行免疫效果监测,HI 试验免疫抗体大于或等于 51og2 的样品判为免疫抗体合格。

2、结果与分析

2.1 免疫重组三价疫苗后不同毒株的免疫效果

共检测 1 999 份家禽血清样品,其中 Re-6株抗体阳性率最高,为 86.84%,Re-7 株、Re-8株的抗体阳性率分别为 71.34%、67.78%, 详细结果见表 1。H5 亚型 Re-6 株和 Re-7 株免疫合格率达到了《禽流感防治规范》免疫合格率 70%以上的要求。

2.2 不同种类家禽的免疫效果

免疫重组 H5 亚型禽流感三价疫苗后,鸡的 Re-6 株抗体阳性率达到 88.52%为最高,其次鸭、鹅,抗体阳性率分别 86.25%、83.26%,详细结果见表 2,不同家禽种类的免疫合格率均达到了《禽流感防治规范》免疫合格率 70%以上的要求。

鹅 Re-7 株抗体阳性率达到 80.00%为最高,其次鸭、鸡,抗体阳性率分别 71.25%、68.14%,详细结果见表 3,其中鹅和鸭的免疫合格率均达到了《禽流感防治规范》免疫合格率70%以上的要求。

鸡 Re-8 株抗体阳性率最高,达到 82.00%,其次鸭、鹅,抗体阳性率分别57.50%、43.36%,详细结果见表 4,只有鸡的免疫合格率均达到了《禽流感防治规范》免疫合格率 70%以上的要求。

2.3 不同免疫次数免疫效果

在监测的 1 999 份禽血清中,免疫一次 21天后采样监测 Re-6 的抗体阳性率最高达到79.47%,其次为 Re-8 和 Re-7,分别为 60.79%和 51.05%,详细结果见表 5,一次免疫只有Re-6 能达到《禽流感防治规范》免疫合格率70%以上的要求。二次免疫后,Re-6、Re-7、Re-8 的抗体阳性率达到比较高的水平,抗体阳性率均超高 80%以上。三次免疫后 Re-6 和Re-8 能够维持较高的水平,而 Re-7 抗体阳性率反而下降,原因有待进一步核查。

3、讨论

(1)从疫病流行时间、传播范围、危害程度等情况来看,H5 亚型禽流感仍然是至今对家禽业生产、人类身体健康的巨大威胁。在目前已有H7N9 禽流感疫苗的情况下,继续研究 H5 亚型禽流感疫苗免疫效果仍是相当必要。同时,通过对目前在用的 H5 亚型三价疫苗免疫效果的试验,并由此得出在免疫程序上的改良和完善,也对即将推出的 H5 亚型以 Re-10 株为主的禽流感疫苗免疫效果起到参考的作用。

(2)三种毒株中,无论是不同的家禽种类、免疫次数,基本都是 Re-6 株抗体水平最高,其次是 Re-8 株,Re-7 株最低。近年来我国禽群中流行的 H5N1 亚型 AIV 主要属于 Clade2.3.2、Clade2.3.4 和 Clade7 [2] ,再细分下去就是 2.3.2.2、2.3.4.4、7.2。从地域分布,南方主要是 2.3.4.4 和2.3.2.2,北方主要是 7.2 和 2.3.4.4。2.3.2.2 对应的是 Re-6 株疫苗,7.2 对应的是 Re-7 株疫苗,2.3.4.4 对应的是 Re-8 株疫苗。地处南方的东莞市,以 Re-8 株疫苗的抗体水平作为判断禽群抗体水平是否合格的指标,在禽流感流行病学研究上是有一定依据的。

(3)由于 H5N1 Re-7 株本身毒株特性的原因,在接种鸭群后 Re-7 株抗体水平略低于Re-6 和 Re-8 株的抗体水平 [3] ,但相对于Re-6株在流行性上来说,仍然有防疫的价值。所以,在 2017 年 3 月,农业部发布公告,批准国家禽流感参考实验室推荐的 H5 亚型高致病性禽流感疫苗生产毒种变更,其中发布“重组禽流感病毒 H5 亚 型三 价灭 活疫 苗 (H5N1,Re-6 株+Re-8 株 +Re-10 株)”兽药产品试行规程、质量标准、说明书和标签,此次变更之后,原来的三价灭活疫苗(Re-6 株 +Re-7 株 +Re-8 株)将调整为 Re-7 株 +Re-8 株 +Re-10 株。证明Re-6 株已经不再具有临床诊断意义,Re-10 株的上线将会是防控 H5 亚型禽流感的一种有效措施。

(4)重组禽流感病毒 H5 亚型三价灭活疫苗(H5N1,Re-6 株 +Re-7 株 +Re-8 株)在水禽群上的抗体值不如在鸡群上的抗体值,主要是因为该疫苗是在鸡群上分离出来的。有研究指出,相比于在水禽上使用该疫苗,使用禽流感灭活疫苗(H5N2 亚型,D7 株)更有效果 [4],这可能是由于 D7 株疫苗毒株分离于禽流感的天然宿主鸭,为自然弱毒,免疫原性好,所以对水禽有较为理想的免疫保护效果。这与东莞市水禽规模场的生产应用相吻合,水禽规模场均指定使用禽流感灭活疫苗(H5N2,D7 株),证明对水禽的免疫,更适用于 H5N2 亚型 D7 株。

(5)根据试验的结果,禽群经过一次免疫以后,抗体水平并不能完全达到 70%以上的要求,不能抵御野毒的侵袭。实施二次免疫后,3 个毒株的抗体阳性率均处于较高的水平,全部均能达到《禽流感防治规范》免疫合格率 70%以上的要求,所以养殖场落实二次免疫十分必要。在三次及以上免疫中,Re-7 株抗体水平反而下降,是否和 Re-6 和 Re-8 株的抗体水平上升到一定程度,对 Re-7 株产生交叉免疫保护现象,就和 Re-7 株和 Re-4 株存在类似的情况一样[5],还有待进一步研究。

参考文献

[1] 赵君和.2016 年禽流感的流行特点和防控策略[J].中国畜牧兽医文摘,2016,32(1):1-3.

[2]张毅,王幼明.我国禽流感研究进展及成就[J].微生物学通报,2014,41(3):497-503.

[3]李叔伟.樱桃谷鸭免疫重组禽流感病毒 H5 亚型三价灭活疫苗 (H5N1,Re-6 株 +Re-7 株+Re-8 株)的临床效果[J].广东畜牧兽医科技,2016,41(5):8-9.

[4] 朱建翠. 禽流感灭活疫苗 H5N2 D7 株与H5N1 Re-6 株对鸭的免疫效果研究[J].中国动物检疫,2016,33(6):63-67.

[5] 罗江华.吴朝芳.樊莉,等. H5N1 亚型禽流感Re-7 疫苗在鸡群的免疫抗体消长规律[J].兽医实验室,2017,(9):70-71.

作者:陈松春1,卢毅荣 2,王自强3,黄育浩3,潘杰3*(1.东莞市常平镇农业技术服务中心,广东东莞 523560;2.东莞市茶山镇农业技术服务中心,广东东莞 523378;3.东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞 523086)

* 通讯作者: 潘杰(1980-),男,广东韶关人,兽医师,从事动物疫病防控工作 邮箱:751564369@qq.com

责任编辑:曹伟胜

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