禽支原体检测技术进展

鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是家禽养殖业中危害最大的两种支原体,以鸡毒支原体更易致病,能使大多数感染鸡的生产性能下降,造成较大的经济损失。而目前,国内对禽支原体的控制主要是依靠疫苗免疫和药物治疗。由于该疾病传播迅速、在体内带菌时间长、可经蛋传播及容易产生耐药性,这些都给支原体病的控制和净化带来了困难。防控禽支原体感染的最有效方法,就是培育建立无该病原的健康种鸡群,从源头上切断该病的传播。而在净化过程中,检测技术显得尤为重要。本文拟就禽支原体的各种检测方法以及鉴别诊断技术进展作一简要综述,以期为各种禽场制定和实施禽支原体净化方案提供参考。

1、前言

禽支原体是很小的能自我复制的原核生物,无细胞壁,仅有细胞浆膜构成,其菌落形态为“煎蛋形”[1] 。因此对作用于细胞壁的抗生素无效。菌体大小 0.2~0.5滋m,球形或球杆形,姬姆萨染色良好,MG 和 MS 均能发酵葡萄糖和麦芽糖,产酸不产气,不能水解精氨酸,不具备磷酸酶活性。现已从各种禽类中共分离到近 30 种支原体,但在家禽中,目前只有鸡毒支原体和滑液囊支原体可以侵入细胞内,从而致病 [2] 。鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum,MG)感染是家禽中致病性最强、造成经济损失最大的支原体病,其所引起的疾病通常称为慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease,CRD),典型症状是流鼻涕和咳嗽、食欲降低、体重下降和气管啰音。幼鸡生长不良,废弃率增加,成鸡产蛋量下降,造成严重的经济损失,影响养禽业的发展。各种年龄的鸡均可以感染,雏鸡更易感,4 ~ 8周龄的肉用仔鸡最易暴发本病,感染高峰期在6~8 周 [3] ,该病能垂直传播也能水平传播 [4] ,寒冷季节多发,成年鸡多呈隐形感染。只有 MG单一感染时死亡率不算高,在 10% ~30%,如有其他疾病混合感染或者某些应激因素存在时,其死亡率可达 30%以上[5] 。滑液囊支原体(Mycoplasma symoviae,MS)感染通常表现为亚临床型上呼吸道感染,有时引起系统性感染并损害关节的滑液囊膜和腱鞘,引起渗出性滑膜炎、腱鞘炎和滑液囊炎等。当与鸡毒支原体、新城疫或传染性支气管炎的病原混合感染时,引起气囊炎。鸡的最早感染日龄为 1 周龄,4~16周龄的鸡易发生急性感染。可经蛋传播也能通过呼吸道传播,并常达 100%,鸡的发病率通常为 5%~15%,死亡率 1%~10%。与其他疾病混合感染后发病率和死亡率会明显升高。

MG 与 MS 呈世界性分布。据悉,我国有50% ~ 80%的鸡群感染鸡毒支原体 [6,7] ,感染率越来越高,不容乐观。鸡群感染后,产蛋率减少10% ~ 20 %,体重降低 38 %,饲料转化率下降21%,胴体质量也变差,同时药费开支也不断升高 [8] 。应用血清学反应检测到国内许多地方的鸡群都有感染滑液囊支原体,有的地区较严重,江苏部分地区鸡场鸡群 MS 血清阳性率最高达到82.4%,最低为 38.9%,说明这些鸡场均存在不同程度的鸡滑液囊支原体感染 [9] ,国内其他地方的滑液囊支原体感染情况也不容乐观 [10]

国内对鸡毒支原体和滑液囊支原体的防控是以疫苗免疫和药物治疗为主,但常常存在以下缺点:使用活疫苗时,免疫期间限制了治疗方案的选择。使用灭活苗时,隐性感染的父母代鸡群成为肉鸡的感染源。使用抗生素则成本高,并且容易产生耐药性 [11] ,甚至会产生大量已感染的后代鸡群。因此,要培育建立无 MG 及 MS 的健康种鸡群显得尤为重要。而在净化过程中,检测技术起着重要的作用。目前国内外已建立多种检测 MG 和 MS 的方法,主要包括病原的分离与鉴定、血清学方法、分子生物学方法等。

2、检测方法

2.1 病原的分离与鉴定

根据流行病学、临床症状和病理变化特点可对疾病进行初步诊断,确诊则需要进行病原分离与鉴定。MG 诊断的标准方法是病原体的分离与鉴定,MG 的培养要用特殊的培养基,一般的分离方法难以获得成功。即便用鸡胚接种,也只能从少数材料中获得。通常需要富含蛋白质的培养基,MS 的生长需要另外补充辅酶Ⅰ(NAD),常用改良的 Frey 氏培养基 [12,13] (见表 1),37℃培养3~5 天生长良好。培养物中需添加猪、马或鸡的血清达 10%~15% [14] ,其中以添加灭活的猪血清为最好 [15] ,补充酵母浸出液有益于生长。加入醋酸铊(1∶4 000)和青霉素(2 000 IU/mL)可防止外源性细菌和真菌污染。培养基中的任何一成分都可能影响到分离率,其中影响最大的是猪血清的质量。所采集的每一头猪的血清支持支原体生长的能力均不一样,应用事先已知的支原体菌种进行筛选。若培养基经过预先测定,从发病鸡的病变部位进行分离,分离率可达100%。

隋兆峰等 [16] 从山东地区发生呼吸道疾病的商品肉鸡场采集病料进行 MG 分离鉴定,共分离出 36 株鸡毒支原体,约 10%~30%的分离率。病料采集时用灭菌的棉拭子无菌操作蘸取发病鸡鼻腔、眶下窦、气管及气囊等处的排泄物或分泌物,直接接种到肉汤培养基上。如需要短期运送,则应将样品放入 4℃或冷包装内,也可无菌操作采集病变处的组织块接种到肉汤培养基中,再对其培养与鉴定,将接种到肉汤培养基中的样品置于 37~38.5℃的恒温培养箱 3~5 天。待培养基变黄之后,接种到固体琼脂培养基上以形成菌落,经纯化、回复试验排除 L 型细菌,然后通过 PCR 扩增、测序或者免疫荧光试验进行支原体鉴定 [17,18]

相对 MG 而言,MS 的分离与鉴定较易成功。关节深处的关节液也可直接接种肉汤培养基。滑膜、气囊膜、气管以及肝、肺、脾等内脏器官,可无菌操作取小块,直接投入肉汤培养基中,37℃培养 24 h 后,经纯化、细菌回复试验,出现典型的支原体菌落时表明分离成功。丁美娟 [19] 通过对河南、江苏和广东等省鸡场疑似 MS感染的病鸡,无菌操作采集肿胀跗关节腔内的关节液及内容物进行鸡滑液囊支原体的分离鉴定。从采集的 102 份有腿瘫症状病鸡的肿胀爪垫或附关节内容物中分离出 10 株鸡滑液囊支原体,分离率为 7.14%~14.29%,平均分离率9.8%。在实践中,病料中常存在非致病性支原体,因其繁殖速度快,从而掩盖了致病性支原体的生长,给鉴定工作带来一定困难,而且过程复杂,所以在临床上较少采用病原的分离与鉴定来诊断本病,只是有时为了确诊,特别是要区分MG 和 MS 时,或者有其他特定研究需要时,在有条件的实验室才进行其分离与鉴定。

2.2 血清学诊断

血清学诊断是指利用抗原能够与相应抗体特异性结合的原理而建立的一种检测方法。有关禽支原体检测的血清学方法有平板凝集试验(SPA)、血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)和琼脂免疫扩散试验(AGP)。血清学检测方法是临床诊断支原体感染应用较广泛的方法,由于操作相对简单,更适合于群体的疾病监测。

2.2.1 平板凝集试验(SPA)

当颗粒性抗原和相应的抗体血清结合后,在电解质的参与下,抗原和抗体会逐渐聚集成肉眼可见的凝集团块,即为凝集反应 [20] 。取被检鸡血清或全血 1 滴置于洁净的白瓷板或载玻片上,加 1 滴 MG 或者 MS 抗原,充分混合并涂成直径约 2 cm 的液滴,轻轻摇动,当温度为 20℃左右时,2 min 以内出现 50%凝集者为阳性,2~5 min 出现凝集者为可疑,5 min 内不出现凝集者为阴性。平板凝集试验是目前使用较多的一种支原体血清型检测方法。因该方法快速,相对低廉和灵敏,已经广泛用于鸡群疾病监测和初步筛选,但该方法的缺点是有时会出现非特异性 [21,22] 。有些实验室对血清用生理盐水进行倍比(1∶2)稀释来确定凝集终点,血清凝集效价达到 1∶8 或更高时判断为阳性,以此区分特异性与非特异性反应。

2.2.2 血凝抑制试验(HI)

有些病原表面有血凝素,能够凝集某些动物或人红细胞,称为血凝现象,而当血凝现象被特异性抗体所抑制时,则称血凝抑制现象,利用这种特性进行血清学试验,即为血凝抑制试验 [20] 。MG 能凝集鸡的红细胞,MS 能凝集鸡或火鸡的红细胞,感染禽支原体后鸡的血清中具有血凝抑制抗体,因此可用血凝抑制试验诊断本病。HI 是一种非常特异的诊断方法,主要检测血清中的 IgG,赵化民等 [23] 对 HI 的简易操作技术进行研究,结果表明具有准确特异的优点,但由于操作较为复杂,血凝抑制试验通常用于进一步确诊 SPA 或 ELISA 检测的阳性鸡,特异性强,是可靠的检测 MG 感染的方法,但是 HI 耗时长,灵敏性较差,且无商品化试剂盒。

2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA 可用于检测抗原或抗体,具有灵敏、快速和便捷的优点 [24] 。Talkingtou 等 [25] 在 20 世纪80 年代就建立了检测 MG 抗体的 ELISA 方法。杨百亮等 [26] 采用抗 MG 阳性血清包被酶标板作为捕捉抗体,以 4 株 MG 特异单克隆抗体作为二抗和酶标羊抗鼠 IgG 作指示抗体,建立了一种检测鸡蛋卵黄中 MG 的双夹心 AC-ELISA,该过程只需要 6 h 左右便能得出检测结果 ,该方法的阳性检出率比分离培养法高、重复性好。美国 IDEXX 和 Synbiotics 公司的 MG 商品化ELISA 试剂盒已广泛用于鸡群监测和血清学诊断。人们一直在努力提高 ELISA 的灵敏度和准确性,比如通过鉴定和纯化 MG 等主要免疫原性蛋白作为 ELISA 抗原。ELISA 也可用于检测呼吸道洗液和卵黄样品中的 MG 抗体 [27,28] 。MS的商品化 ELISA 试剂盒市场上有售。包含p46-52 区域 原的半纯化制品有望作为ELISA 诊断抗原 [29] 。与 SPA 相比,ELISA 灵敏度稍差,但特异性更强,而与 HI 相比,特异性稍差而灵敏度更高。在许多大型养殖公司和专业诊断实验室,MG 的血清学试验往往选择 ELISA。

2.2.4 间接免疫荧光试验(IFA)

间接免疫荧光试验是用对应某一种抗原的抗体(称为一抗)与抗原孵育结合,再采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体,称为二抗,二抗上偶联有荧光素分子,与抗原孵育结合后在荧光显微镜下观察,对组织抗原进行定性和定位检测,或对自身抗体进行定性和滴度测定。免疫荧光法对实验室分离株是普遍适用的诊断方法,适用于鉴定在琼脂板上长出明显菌落的支原体,不能直接用于感染渗出液和感染组织检测,因为支原体体积太小,在光学显微镜下无法鉴别,而且相应的阳性和阴性对照渗出液或组织不容易获得。目前利用该方法进行禽支原体检测的报道较少,仅局限于少数专业实验室。由于该方法成本高、需专业人员操作,而且容易产生非特异性荧光,所以不能满足批量样品检测的要求。

2.2.5 琼脂免疫扩散试验(AGP)

AGP 就是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板相对应的的孔中,两者各自向四周扩散,经一定时间后,若二者有特异性,就在比例合适处形成白色沉淀线。根据沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀线之间的关系,可对抗原或抗体进行定性分析和纯度鉴定。将待检菌接种到液体培养基中,培养生长后,离心收获菌体,通过冻融或超声波裂解制备抗原,将未知抗原加入琼脂平板的一孔中,再向邻孔加入已知的支原体特异性高免血清,若凝胶中抗原、抗体是特异性的,则形成抗原抗体复合物,在两孔之间出现清晰致密白色的沉淀线,为阳性反应。若在 72h 时仍未出现沉淀线则为阴性反应,可对待检菌做出初步鉴定 [30] 。该方法操作容易,费用经济,但会出现一部分假阳性,在实践中该方法较少被应用。

2.3 分子生物学方法

禽支原体病的分子生物学检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量 PCR、核酸探针法、十二烷基磺酸钠 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳试验 (SDS – PAGE)、环介导等温扩增(LAMP)、表面增强拉曼光谱分析法(SERS)等,其敏感性和特异性均较血清学方法高,并且可用于各支原体的鉴别诊断。

2.3.1 聚合酶链式反应(PCR)

PCR 能够在体外选择性扩增 DNA 或 cD-NA。屈小玲等 [31] 较早建立了通过设计 MG 种特异引物进行 PCR 检测鸡毒支原体,其结果最低能检出 18pg 的鸡毒支原体 DNA,说明该方法有较高的特异性和灵敏性。丁美娟等 [32] 根据鸡滑液囊支原体的 16S rRNA 设计引物,对 1 株MS 阳性株、5 株临床分离鉴定的 MS、2 株鸡毒支原体、1 株多杀性巴氏杆菌、1 株沙门菌、1 株大肠杆菌和 1 株金黄色葡萄球菌进行 PCR 扩增,结果只有 MS 出现 1 077 bp 特异性条带,能检出 MS 的最低 DNA 量为 1 pg。赵杰等 [33] 以鸡毒支原体的 mgc2 基因设计引物建立的套式PCR 能够 扩增的目的基因片段的大小为300 bp,能检测出 DNA 的最小质量浓度为0.18 fg/滋L。刘婷 [34] 针对滑液支原体的 pdh A 基因、鸡毒支原体的 gap A 基因、大肠杆菌的 phoA 基因、沙门菌的 inv A 基因分别设计 2~3 对特异性引物,建立了针对这 4 种禽源常见致病菌的多重 PCR 检测方法。Camir Ricketts 等 [35,36]同时对 vlhA3.04、vlhA3.05 和 mg0359 3 段特异性序列进行 PCR 扩增,进行琼脂糖凝胶电泳,发现只有鸡毒支原体 ts-11 型疫苗株表现为全阳性,而其他菌株则部分或者全部为阴性,这一方法将进一步补充目前的方法,以区分出鸡毒支原体的 ts-11 型疫苗株和野毒株。PCR 技术简单、快速、灵敏度和特异性也较高 [37] ,用于检测 MG 特异性 DNA 的商品化 PCR 试剂盒,在诊断实验室(如美国 IDEXX 实验室)和研究机构已得到广泛应用 [38] ,但该方法需要进行凝胶电泳对结果进行分析,有时会产生假阳性。最近,Hung-Chih Kuo 等 [39] 建立了一套专门用于滑液囊支原体的 MS iiPCR/POCKIT TM 新型检测系统,该系统以便携式 POCKIT TM 设备为基础,进行绝热的等温聚合酶链反应(insulated isother-mal polymerase chain reaction,iiPCR)分析。该方法具有良好的特异性和灵敏性,且便于操作和携带,由于该检测方法刚被建立不久,因此还未被广泛采用。

2.3.2 实时荧光定量 PCR

实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-timePCR)是一种在 DNA 扩增反应中,加入荧光基团,以荧光化学物质测每次 PCR 循环后产物总量的方法,是通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析的方法。孙俊颖、赵鑫等 [40,41] 根据 GenBank 中的 MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以 MG 基因组 DNA为模板扩增其 16S rDNA 基因片段,并克隆于pMD18-T 载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了 MG SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 检测方法。以重组质粒为模板建立荧光定量的标准曲线,并进行特异性、灵敏性和重复性及临床样本检测试验,结果表明,实时荧光定量 PCR有较高的特异性、稳定性和敏感性,重现性好,检测率明显高于常规 PCR。罗思思等 [42] 还建立了鸡毒支原体强弱毒株荧光定量 PCR 鉴别检测方法,Dijkman R 等 [43] 利用 obg 基因中的核苷酸差异,设计特异性引物建立了区别滑液囊支原体野毒株和 MS-H 疫苗株的检测方法,为MG 强、弱菌株的鉴别以及 MG 和 MS 的防控与净化提供了新思路。

2.3.3 核酸探针法

核酸探针是指已知序列的核酸片段用标记物标记后,能够和它互补的序列杂交形成双链,能够用于检测未知核酸中的特定基因序列。任何一种病原体都有其独一无二的核酸片段,对这些片段进行分离和标记,就能够制备出探针,用于疾病的诊断或研究。核酸探针有 DNA 探针、cNDA 探针和 RNA 基因探针,其长度一般由几十到几百个碱基组成。高以明等 [44] 根据鸡毒支原体和滑液囊支原体的 16S rRNA 基因序列,设计并合成了探针鸡毒支原体和滑液囊支原体共同目的基因,经聚合酶链式反应,得到大小约 580 bp 片段,斑点杂交试验对鸡毒支原体和滑液囊支原体均呈阳性,其检测灵敏度分别可达到 2 ng 和 3 ng。表明该方法快速、特异性和敏感性高。核酸探针可用以定性或定量检测特异 RNA 或 DNA 序列,但由于操作繁琐复杂,而且成本较高,在动物疫病检疫中不能够被广泛应用,仅当对病原作深入研究时才使用。

2.3.4 十二烷基磺酸钠 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳

试验(SDS – PAGE)PAGE 即聚丙烯酰胺凝胶电泳,是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质,依据蛋白质分子的电荷、分子大小和分子形状进行蛋白质分离的一种电泳技术。SDS 是一种蛋白质变性剂,它可以破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用,当 SDS存在时,蛋白质在电场中的迁移率仅与其分子量有关,因此常用来鉴定蛋白质的分子量 [45] 。孔意端等 [46] 对来自不同地方的鸡毒支原体分离株和抗生素诱导产生的耐药鸡毒支原体,用SDS-PAGE 比较分析其结构蛋白,结果表明,不同地区分离到的鸡毒支原体结构蛋白存在一定差异,但都具有共同高表达的蛋白条带,且诱导产生的耐药株结果一致。蛋白质免疫印迹分析结果显示,所有临床分离株的 MG 在分子量大小约 75 kD 和 55 kD 均出现特异条带。用这种方法分析鸡毒支原体的结构蛋白,可以表现出种株间的微小差异,可鉴定种株。

2.3.5 环介导等温扩增(LAMP)

环介导等温扩增技术是 Notomi [47] 等在 2000年发明的一种体外恒温扩增核酸的方法。能在恒温条件下,短时间内进行核酸扩增。Zhang等 [48] 以 MG 丙酮酸脱氢酶复合体 PDHa 基因对MG 进行 LAMP 检测,发现检测灵敏度比现有PCR 方法高 10 倍以上,是检测 MG 感染的重要手段。与常规 PCR 相比,LAMP 不需要热变性、温度循环、琼脂糖电泳和紫外观察等过程。该方法的灵敏度、特异性都比常规 PCR 更优秀,不依靠任何专业的仪器设备,就能实现现场快速检测,且成本远低于荧光定量 PCR [49]

2.3.6 表面增强拉曼光谱分析法(SERS)

表面增强拉曼 (Surface-Enhanced RamanScattering,SERS)是用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品,或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中,在激发区域内,由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强。Suzanne 等 [50] 利用基于纳米银的表面增强拉曼光谱分析直接检测鸡毒支原体,并能区分出 MG、MS 以及 6/85、F、ts-11疫苗株,且该方法的灵敏度比普通 PCR 和实时荧光定量 PCR 高 100 倍,具有良好的特异性和灵敏度。但由于该检测方法需要专门的仪器设备,纳米银或纳米金等成本较高,且对实际检测得出的拉曼光谱的分析结果不太直观,因此在实际应用中少之又少。

3、小结

根据我国《动物防疫法》相关规定,鸡毒支原体感染属二类动物疫病,该病可对养禽业造成严重损失,目前国内还没有自行培育出无支原体感染的种鸡群,基本上所有鸡场都有支原体感染,一般情况下无明显症状,当受到不利因素应激时,就可能暴发疾病造成大量死亡。因此引种时要考虑种禽场 MG 和 MS 的健康状况,平时加强饲养管理等生物安全综合措施。农业主管部门和养禽业越来越重视禽支原体感染的危害,并逐步意识到该病净化的重要性。随着科学技术的发展,各种禽支原体检测方法也在不断优化完善中。科研部门应根据行业需求,加强研发快速简便、灵敏有效、有利于净化的禽支原体检测技术。各种禽企业应结合自身实际情况,积极实施支原体净化,并不断调整和优化净化方案。

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作者:向勇、曹伟胜(华南农业大学兽医学院,广州 510642)

基金项目 : 广东省家禽产业技术体系(2017LM1114); 国家肉鸡产业技术体系 (CARS-41-G16)

责任编辑:任涛

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