鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原的研制与应用

应用标准型 C79-1 和 C79-7 鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌标准株,制备了鸡白痢鸡伤寒平板凝集试验染色诊断抗原。该抗原特异性强,与鸡新城疫、鸡传染性鼻炎及鸡支原体等 9 种鸡血清无交叉反应,敏感性高,稳定性好,4℃保存 36 个月,检测效果不变,应用此抗原进行平板凝集反应检测鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌抗体,操作简便,检测快速,适于普及。

鸡白痢 – 禽伤寒病是由肠杆菌科沙门菌属的鸡白痢沙门菌和禽伤寒沙门菌感染引起的禽类疾病[1] 。这 2 种菌同属于沙门氏菌的 D 血清群,由于鸡白痢和禽伤寒在临床症状、病理变化、诊断及防控等方面有许多相似之处,一般统称为鸡白痢。鸡白痢虽危害不剧烈,但在鸡场中长期存在,流行范围广,种鸡感染后,不仅影响自身的生产性能,长期隐性带菌,还能传给后代,至雏鸡大批发病、死亡,是重要的“蛋传性”、细菌性禽类疾病之一 [2] ,严重困扰养鸡业的发展,沙门氏菌还可以感染人,存在潜在的食品安全威胁,可能导致难以估计的损失。目前,国内外尚无有效疫苗预防,药物防治容易产生耐药性,种鸡净化是防治该病的有效手段,在我国一般要求种鸡群的鸡白痢阳性率不能超过 0.2% [3] 。国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012 年 -2020 年)》提出,2020 年全国所有种鸡场的鸡白痢(沙门氏菌)达到净化标准 [4] 。鸡白痢净化的关键步骤是对种鸡的检疫。平板凝集诊断法是检疫鸡是否患鸡白痢最常用的方法,该法具有灵敏度高、操作简便、成本低及适于大量样品的快速检测等多种优点。本研究成功研制了鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原,并应用于临床检测,为鸡白痢的净化工作奠定了基础。

1、材料与方法

1.1 菌种与标准血清

标准型 C79-1 和 C79-7 鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌为中国兽医药品监察所生产。

1.2 试剂

氯化钠(分析纯)、甲醛溶液(37.0%~40.0%,分析纯)、1:500 吖啶黄溶液、磷酸盐缓冲盐水(0.07mol/L,pH7.0)、结晶紫、乙醇、甘油、普通琼脂培养基、马丁肉汤液体培养基、硫代硫酸钠琼脂培养基(本公司质量监察部提供)。鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集标准抗原、鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌标准型与变异型阳性血清和阴性血清均为中国兽医药品监察所生产。硫乙醇酸盐培养基、酪胨琼脂培养基和葡萄糖蛋白胨汤培养基为中国兽药监察所生产。

1.3 鸡白痢鸡伤寒多价染色平板抗原的制备

1.3.1 菌液制备

取冻干保存的标准型 C79-1 和 C79-7 鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌标准株菌种,分别画线接种于普通琼脂平板,37℃培养 24h,选择典型的光滑型菌落,接种于马丁肉汤液体培养基,置37℃培养 24h,经肉眼及显微镜检,选取纯粹的菌作为菌种,接种于硫代硫酸钠琼脂扁瓶,每瓶5mL,摇晃均匀,置 37℃培养 48h,逐瓶用肉眼检查,弃去污染杂菌者。

1.3.2 收获与灭活

吸弃扁瓶中凝集水,每瓶加入含 2%甲醛溶液的磷酸盐缓冲盐水(0.07mol/L,pH7.0)30mL,洗下培养物,收集于带玻璃珠的玻瓶中,经振荡打碎菌块,置 37℃灭活 48h,期间振荡数次,后作无菌检验。然后用灭菌的棉花纱布漏斗滤过菌液于大玻璃瓶中,加入约 2 倍量(以菌体全部沉淀为准)的 95%乙醇,沉淀 3 日以上,弃去上清,下沉物再离心,弃上清,离心沉淀物加含 1%甲醛溶液的磷酸盐缓冲盐水(0.07mol/L,pH7.0)悬浮,用 1 号耐酸滤器滤过,然后按麦氏比浊管第一管(相当于 3 亿菌 /mL)为标准进行比浊,确定其菌液浓度,计算出配制抗原所需各组分的用量。

1.3.3 抗原配制

将所需的 1%甲醛溶液缓冲盐水和 1%结晶紫乙醇溶液 (抗原中结晶紫最终含量为0.03%)在匀浆机中以 7 000r/min 均质 3min,然后加入最终含量为 10%的甘油,继续均质4min,最后加入菌液再以 2 000r/min 均质 2min即成。

1.4 多价染色平板抗原检验

1.4.1 物理性状

主要观察抗原的颜色、剂型及是否有自凝集等。

1.4.2 无菌检验

随机取样品 5 瓶样品,按照《中华人民共和国兽药典》二 Ο 一五年版三部附录 3 306 进行无菌检验。

1.4.3 效价测定

在平板上分两处各滴抗原 1 滴,每滴为0.05mL。然后分别滴加鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌标准型与变异型阳性血清标准品各 0.05mL,混合。

1.4.4 特异性检验

在平板上滴加抗原 12 滴,再分别滴加鸡新城疫、鸡传染性鼻炎、鸡传染性法氏囊病、鸡支原体、鸡传染性支气管炎、禽流感、鸡大肠杆菌、鸡传染性喉气管炎、鸡传染性贫血等阳性血清和鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌标准型与变异型阳性血清、阴性血清各 1 滴,进行平板凝集试验。

1.4.5 保存期试验

选取制备的染色抗原保存于 4~8℃条件下,12 个月、24 个月和 36 个月后取出做近期效价测定,观察抗原保存期。

1.5 多价染色平板抗原的临床应用

应用研制的诊断抗原,对鲁北地区鸡场鸡白痢的流行情况进行调查,针头刺破鸡的肱静脉,每只取血 0.05mL,取等量抗原,混合均匀后,涂散至直径约 2cm 的液面。2min 内判断结果:发生 50%(++)以上凝集者为阳性,不发生凝集着为阴性反应,介于上述两者之间者为可疑反应。同时应设强阳性、弱阳性、阴性血清对照(各 1 滴),分别滴加抗原 1 滴混匀,在 2min内,强阳性血清应出现 100%凝集,弱阳性血清出现 50%凝集,阴性血清不凝集。并选取部分鸡,用购自中国兽医药品监察所的鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集标准抗原进行符合试验。

2、结果

2.1 染色平板抗原的物理性状观察

本品为紫色的混悬液,静置后菌体下沉,经振荡后呈均匀的悬液。将其滴于平板,在 2min内不出现自凝现象。

2.2 无菌检验

观察 10 天,制备的抗原样品无细菌生长。

2.3 效价测定

在 2min 内液滴中有明显凝集块或粒状凝集物,液体几乎完全清亮。约 75%凝集。

2.4 特异性试验

制备的染色抗原除鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌标准型与变异型阳性血清出现凝集反应外,其余 9 种血清均无凝集反应。

2.5 保存期试验

选取制备的染色抗原保存于 4~8℃条件下,效价检测结果如下:

2.6 临床应用

对鲁北地区鸡白痢流行病学调查,部分鸡用自制抗原与中监察所抗原同时检测,结果二者符合率为 100%,说明自制的平板凝抗原可用于临床种鸡场鸡白痢的净化检测工作,具体结果见表 1。

3、讨论与小结

(1)李磊等 [5] 从郑州某鸡场死亡雏鸡的肝脏、脾脏和肾脏中分离纯化细菌,通过致病性试验、生化试验,并结合临床症状、病理变化和培养特性鉴定为鸡白痢沙门氏菌。经传代分离株、培养细菌、收集细菌、灭活细菌、浓缩抗原、调整抗原浓度、无菌检查及染色制备鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原,建立了检测鸡白痢血清抗体的微量平板凝集法。

(2)本研究成功研制了 5 000mL 鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原,敏感性高、稳定性好,与其他血清无交叉反应,适合基层兽医工作部门和鸡场鸡白痢的抗体检测及流行病学调查,应用效果良好。在诊断抗原的研制过程中也遇到了一些问题,一开始做出的抗原颜色较淡,检测结果不易判定,后换了另一公司的结晶紫,才达到了理想的结果。

(3)鸡白痢平板凝集诊断法对雏鸡的诊断效果差,适用于成年鸡 [6] ,平板凝集法在临床检测应用中容易造成误差,主要注意事项如下:①抗原在使用前必须充分摇均匀,有沉淀的不能用,过期失效的不能用。②做本试验前必须做阴、阳血清对照。滴管每次一换,不能重复使用。③平板凝集反应时间一般为 2min,但也不能一概而论,凝集反应要控制在 20~25℃下进行,温度高时可适当缩短反应时间,温度低时可适当延长反应时间,可对凝集反应适当加热,具体操作可用一洁净小箱上铺玻璃板,内设 1~2 个25W 灯泡,既可照明,又可提高反应温度,提高检测的准确性。从冰箱取出抗原、标准血清、待检样品,待其回温达到室温再做检验。④对经验不足的操作者,当检验的样本量不大时,最好能在采血后,分离血清,用血清做检验,效果更好。⑤检疫时用过的反应板如果需要重复利用时,要先用水洗净擦干,再用酒精棉脱脂,用纱布擦干或晾干,否则上次检疫残留物易造成影响 [7] 。⑥有时现场有大量鸡需要检测时,所用注射器或滴管数量较大,需要重复利用,清洗时要用生理盐水,不能用蒸馏水,因为蒸馏水与红细胞接触后,即产生溶血,造成检测反应的假阳性。⑦在现场检疫过程中,有时鸡舍内灰尘过大,落在反应板上往往误诊为凝集颗粒,应特别引起注意的,凝集反应操作时应避免风吹和暴晒,抗原、血清的滴加量一定要准确。

(4)本研究所采用的菌种购自中国兽医药品监察所,所包括的血清型有限,能检测的血清型也是有限的,存在漏检的可能性,下一步工作可以分离其他血清型沙门氏菌,并借鉴该研究的方法,制备成诊断抗原,减少漏检。

参考文献

[1] 刘鹏义. 种鸡场鸡白痢 – 禽伤寒病净化工作的总结[J].中国家禽,2008,30(17):50-51.

[2] 谈建明,刘福安.禽白血病检测方法的建立和比较[J].上海农学院学报,1990,8(2):101-107.

[3] 康永刚,廖云琼,薛忠.鸡白痢和禽伤寒综合防治措施[J].中国畜禽种业,2012,(01):141-142.

[4] 冯永平.种鸡场鸡白痢的净化与防控[J].农业技术与装备,2015,306(06):73-74.

[5] 李磊,娄兴国,李永强,等.鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原的制备[J].河南畜牧兽医(综合版),2008,29(09):9-10.

[6] 曹澍泽,郭玉璞,董国维,等.兽医微生物学及免疫学技术 [M]. 北京:中国农业大学出版社,1992,301-302.

[7] 李跃庭.鸡病现场平板快速诊断[J].山东养禽,1983,(02):60-61.

作者:于新友1 ,李天芝 1 ,王艳2 ,苗立中 2 ,沈志强2(1.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;2. 山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600)

基金项目:山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队项目 (SDAIT-11-16)

作者简介:于新友(1983-),男,山东菏泽人,助理研究员,硕士,主要 从事畜禽疾病诊断及防控研究.

责任编辑:曹伟胜

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