鸭坦布苏病毒冻干卵黄抗体的研制

将鸭坦布苏病毒尿囊液浓缩灭活后制备灭活疫苗,依据制定的免疫程序免疫产蛋鸡,第三次免疫后 14 天,抗体中和效价≥1∶256,收集高免鸡蛋制备冻干卵黄抗体,并对制备的冻干卵黄抗体进行质量评价。结果表明,制备的冻干卵黄抗体中和效价为 1∶90,能有效中和鸭坦布苏病毒,对鸭坦布苏病毒的致病性有较好的预防作用,为鸭坦布苏病毒的预防和治疗提供了一种可行的途径。

鸭坦布苏病毒病又称鸭黄病毒病、鸭出血性卵巢炎,是由黄病毒科黄病毒属蚊媒性病毒鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的一种急性传染病,临床上以产蛋鸭采食量下降,产蛋量骤然减少,卵泡变形、变性,卵泡膜出血、充血为主要病变。产蛋鸭该病的发病率高达 100%,死亡率为 5%~15%。该病传播非常迅速,给我国水禽业造成了严重的经济损失 [1-3] 。卵黄抗体(IgY)是经特异性抗原刺激,由 B 淋巴细胞产生并移行至卵黄中的多克隆抗体,IgY 具有疗效高、作用快、特异性强、安全、无残留等特点 [4] 。本研究成功制备了鸭坦布苏病毒精制冻干卵黄抗体,并对其进行安全性和效力检测,为鸭坦布苏病毒的防治提供新的思路及方法。

1、材料和方法

1.1 材料

(1)鸭坦布苏病毒 JM 株,由广州格雷特生物科技有限公司保存。

(2)140 日龄海兰蛋鸡由增城正大肉鸡中心提供。

(3)10~12 日龄易感麻鸭胚,1~7 日龄健康易感雏麻鸭,150~160 日龄健康易感产蛋麻鸭均购自广州市番禺区无鸭坦布苏病毒病发病史的鸭场。

(4)辛酸为广州展晨生物科技有限公司产品;司本、吐温、硬脂酸铝、优质白油,为广州化学试剂厂产品。

1.2 方法

1.2.1 鸭坦布苏病毒灭活疫苗的制备

取鸭坦布苏病毒 JM 株接种 10 日龄易感麻鸭胚增殖培养,收获 72~120h 死亡麻鸭胚尿囊液。测定收获鸭胚尿囊液病毒半数致死量,以超滤膜堆浓缩后经终浓度为 0.3%甲醛溶液灭活。检验合格后取灭活病毒液 96 份,吐温 -80 4份,充分混匀制成水相,取注射用白油与司本-80 按 96∶4 比例混合,再加入硬脂酸铝 2 份,充分混匀后,高压蒸气灭菌后备用。以油相和水相按照 1∶1 的比例进行乳化,8 000~12 000r/min,2~3 min/ 次,重复 3 次,乳化成鸭坦布苏病毒免疫用灭活疫苗。

1.2.2 免疫产蛋鸡

用上述制备的灭活疫苗免疫 140 日龄海兰蛋鸡 100 只,首次经颈部皮下注射灭活疫苗1.0 mL;间隔 14 天进行第二次免疫,胸部肌肉注射灭活疫苗 1.5 mL;再间隔 14 天后进行第三次免疫,腿部肌肉注射灭活疫苗 2.0 mL;在强化免疫后 2~3 个月,当中和抗体效价<1∶256时,再免疫 1 次,每只胸部肌肉注射灭活疫苗2.0 mL。第三次免疫后 14~21 天,抽样用中和试验测定高免蛋卵黄中鸭坦布苏病毒中和抗体效价。中和抗体效价≥1∶256 为合格,收集高免蛋。

1.2.3 冻干卵黄抗体的制备

将收集的高免鸡蛋进行消毒后,除去蛋清(白)、胚盘和系带,收集卵黄。取 pH3.8~4.0 的酸化水(用 1.0 mol/L 盐酸调 pH 到 3.8~4.0 的纯化水),与卵黄比例为 1∶1 混合,搅拌 5 min,充分混匀后,继续加入酸化水,使酸化水与卵黄终比例为 6.5∶1,搅拌 15~20 min,2~8℃静置5 h,酸化完成后,加入终浓度为 0.2%正辛酸,搅拌 10 min,室温(15~25℃)放置 3 h,用离心机 10 000 r/min 离心 15 min,取上清液即为卵黄抗体。通过测定体效价按比例加入保护剂,充分摇匀,无菌定量分装,分装后迅速进行冷冻真空干燥。

1.2.4 抗体中和效价测定

取待检冻干卵黄抗体进行稀释后,于 56℃水浴 30 min,冷却后备用。将已经灭活处理的待检卵黄抗体用 0.01 mol/L,pH 7.2 PBS 做 4 倍系列稀释至 1∶1 024,每管含量为 1.0 mL。用0.01 mol/L,pH 7.2 PBS 将 JMDE12 悬液稀释至200 ELD 50 /0.2 mL。分别在上述各稀释的卵黄抗体管内加 1.0 mL 的病毒悬液,充分混匀后于37℃水浴 60 min,期间每 15 min 振荡混合 1次。取混合液接种 10~12 日龄麻鸭胚,每个滴度6 枚,0.2 mL/ 枚,同时用 200 ELD 50 病毒悬液作病毒对照,0.2 mL/ 枚;用 0.01 mol/L,pH 7.2 PBS作为正常对照,0.2 mL/ 枚。置 37℃恒温培养箱中孵育。每日照胚 2 次,弃去 24 h 内死亡的麻鸭胚,观察记录接种后 7 日麻鸭胚死亡情况,按Reed-Muench 计算 50%血清中和终点。

1.2.5 抗体安全性检测

取卵黄抗体,分别经皮下注射接种 4 日龄健康易感麻鸭 10 只和 150 日龄健康易感产蛋麻鸭 30 只,接种剂量雏鸭为 2.0 mL,产蛋麻鸭为 6.0 mL,分点注射。同时取 4 日龄健康易感麻鸭 10 只和 150 日龄健康易感产蛋麻鸭 30 只注射生理盐水作为对照。各组隔离饲养,观察 14 日,记录各组鸭只的食欲、精神状态、产蛋鸭只的产蛋量及发病死亡情况。

1.2.6 雏鸭攻毒保护试验

取 4 日龄健康、鸭坦布苏病毒抗体阴性麻鸭 30 只,随机分成 3 组,每组 10 只。第 1 组各皮下注射卵黄抗体 0.5 mL,第 2 组和第 3 组每只皮下注射0.01 mol/L,pH 7.2 PBS 0.5 mL。24 小时后,用鸭坦布苏病毒 JMDE8 株病毒液皮下接种第 1 组和第 2 组雏麻鸭,每只 1.0 mL(10 000 ELD 50 ),观察 14 日,记录鸭只发病的死亡情况。

1.2.7 卵黄抗体对产蛋鸭的治疗效果试验

取 120 只健康易感产蛋麻鸭,随机分成 4组,30 只 / 组,每组每只皮下注射 2.0 mLJMDE8(20 000 ELD 50 )进行攻毒,攻毒后 24 h,第一组颈部皮下注射卵黄抗体 2.0 mL;第 2 组颈部皮下注射卵黄抗体 2.5 mL;第 3 组颈部皮下注射卵黄抗体 3.0 mL;第 4 组对照组,不作任何治疗。观察 14 天,记录产蛋麻鸭发病和产蛋情况。

2、结果

2.1 灭活疫苗制备

对收获的鸭胚病毒尿囊液按 Reed-Muench法计算其半数致死量,结果显示,鸭坦布苏病毒尿囊液病毒含量为 10 -4.33 / 0.2 mL,按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验均无细菌、霉菌生长。鸭坦布苏病毒尿囊液经甲醛溶液灭活后,接种 10 日龄易感麻鸭胚,实验组与对照组麻鸭胚均全部健活,证明病毒灭活完全,灭活后病毒液进行无菌检验,均无细菌霉菌污染。制备的灭活疫苗为油包水型,3 000 r/min,离心 15 min,不分层,且无细菌、霉菌等污染,安全性检验显示制备的灭活疫苗安全。

2.2 中和效价测定结果

对收集高免鸡蛋进行卵黄抗体效价检测结果显示,按 Reed-Muench 计算高免蛋卵黄抗体效价为 1∶322,符合高免鸡蛋的要求。对收集的高免鸡蛋进行卵黄抗体的分离、萃取、过滤、浓缩、冻干,制成冻干卵黄抗体。经检测,制备的冻干卵黄抗体中和效价为 1∶90(见表 1)。

2.3 抗体安全性检测结果

制备的冻干卵黄抗体分别以 2.0mL/ 只注射 4 日龄雏麻鸭,雏鸭食欲、精神状态均良好,生长发育无异常,无任何临床不适反应(见表2);以 6.0mL/ 只注射产蛋麻鸭后均无不良临床反应,精神状况良好,生产性能无明显影响(见表 3)。

2.4 雏鸭攻毒保护试验

卵黄抗体试验组的鸭注射卵黄抗体 24 h后,攻鸭坦布苏病毒后第 3 天有 2 只鸭出现精神沉郁,食欲减退,腹泻症状,持续 2 天后逐渐恢复正常,未出现死亡鸭只,保护率达 100%,观察期结束后随即挑取 10 只鸭剖检,均无肉眼可见的病理变化;攻毒对照组雏鸭在攻毒后 3 天开始出现减食、精神沉郁、腹泻,并部分鸭伴有轻度的神经性症状,随后部分鸭陆续出现死亡,死亡鸭剖检可见肝脏肿大瘀血坏死,脾脏肿大,心肌出血等病理变化。而空白对照组雏鸭一直精神状态良好,试验期间未出现发病、死亡等情况,剖检无肉眼可见异常病变。表明制备的卵黄抗体对鸭坦布苏病有良好的保护效果。

2.5 卵黄抗体对产蛋鸭的治疗效果试验

产蛋鸭人工感染鸭坦布苏病毒后 3 天,部分试验鸭出现精神沉郁、采食量减少,产蛋率急剧下降。在攻毒后 24 h,应用制备纯化的鸭坦布苏病毒冻干卵黄抗体紧急治疗,分别注射卵黄抗体 2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL,鸭只精神状态、采食和产蛋情况均有好转,其中注射卵黄抗体3.0 mL 时,能保护 80%以上的雏麻鸭免受强毒的攻击,产蛋率达 83.6%。治疗后第 4 天鸭群的采食基本恢复正常,部分鸭恢复产蛋。空白对照组产蛋麻鸭产蛋率为 90.0%。结果表明,应用该卵黄抗体能有效控制产蛋鸭坦布苏病毒病,对感染产蛋鸭的采食量和产蛋率的恢复有良好的治疗效果。

3、讨论

卵黄抗体因其具有性质稳定、成本低、产量高的优点,已广泛用于生物及医学领域,在家禽、家畜及人类疾病诊断与防治方面应用广泛,对病毒性疾病治疗更是具有独特优势 [5] ,尤其在预防和治疗一些家禽急性传染病如鸭病毒性肝炎、鸡传染性法氏囊病等发挥重要的作用 [6]

鸭坦布苏病毒病是近年来在我国出现的以鸭产蛋率骤然大幅下降为主要特征的一种急性烈性传染病,该病传播速度快、发病急、发病率高,主要临床表现为感染鸭食欲下降,同时蛋种鸭产蛋数量迅速下降直至停产。正处于高产的种蛋鸭一旦感染鸭坦布苏病毒,产蛋率在短时间内急剧下降,将给鸭场带来巨大的经济损失 [7] 。由于缺乏特效药物,多数养鸭场只能选用抗病毒药物来治疗鸭坦布苏病毒病,效果并不理想。而采用鸭坦布苏病毒抗原免疫蛋鸡制成的鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体,通过被动免疫可使鸭获得坚实的保护力,将是特异性地预防和治疗鸭坦布苏病毒病良好的生物制品。

本研究开展了鸭坦布苏病毒精制冻干卵黄抗体的工作,成功研制了鸭坦布苏病毒冻干卵黄抗体。该抗体具有毒株免疫原性好,生产工艺先进、简单、抗体安全等特点。本研究选择了一株从广东江门地区分离的流行毒株,扩繁浓缩后制备了灭活疫苗,免疫产蛋试验鸡,经多次免疫后,收集免疫蛋,经测定其中和效价为 1∶322,说明成功制备了鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体。通过对雏鸭和产蛋鸭的安全性检验,试验鸭食欲、精神状态均良好,产蛋性能无明显下降,无临床不适反应,表明制备的卵黄抗体安全。通过雏鸭攻毒保护试验,发现本试验制备的卵黄抗体具有良好的预防和治疗鸭坦布苏病毒病的作用。鸭注射该抗体后对野毒攻击保护率高于80%,适合于临床治疗和紧急预防鸭坦布苏病毒病。应用该卵黄抗体能有效控制产蛋鸭坦布苏病毒病,对感染产蛋鸭的采食量和产蛋率的恢复有良好的治疗效果。本研究制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体可以有效预防和治疗鸭坦布苏病毒病,为鸭坦布苏病毒病的紧急治疗和预防提供了一种有效的技术手段。

参考文献

[1]陈桂英.鸭坦布苏病毒病诊断方法概述[J].动物医学进展,2013,34(08):107-111.

[2]曹贞贞,张存,黄瑜,等. 鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志,2010,46(12):3-6+97.

[3]滕巧泱,颜丕熙,张旭,等.一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J].中国动物传染病学报,2010,18(06):1-4.

[4]吴义龙,费荣梅. 鸡卵黄抗体 IgY 研究进展[J].畜牧与兽医,2013,45(03):94-98.

[5]M.Yegani,D.R.Korver,洪胜辉,张宜辉. 卵黄抗体作为抗生素替代品在家禽生产中的应用[J].中国家禽,2010,32(13):1-4.

[6]贾传忠.鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制[J].中国动物检疫,2012,29(03):47-48.

[7]韩青,赵丽青,许美玲,等.鸭坦布苏病毒病研究进展[J].动物医学进展,2015,36(05):103-106.

作者:蔡丝丝,王小庆,魏平华(广州格雷特生物科技有限公司,广州 510730)

基金项目:产学研协同创新重大专项(201504281643265)

责任编辑:曹伟胜

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