2013 年 3 月，我国首次报道人感染 H7N9 流感病毒的病例，之后H7N9 流感病毒在我国反复流行，至今已发生了第五波流行。随着时间的推移，H7N9 流感病毒从对家禽无致病性，逐渐出现对家禽高致病性的变异毒株，且污染范围不断扩大，形成高致病性和低致病性毒株同时流行的局面，给养禽业造成严重危害。H7N9 亚型禽流感病毒出现同源性、致病性和抗原性等方面的差异；活禽交易市场（主要是农贸市场）在家禽生产和贸易链中仍是 H7N9 亚型禽流感病毒污染率较高的环节，相关的运输、市场屠宰和销售等行为都有助于该病毒的传播扩散；鸡在各种动物中比较容易带毒，其他家禽对 H7N9 亚型禽流感病毒的传播也不容忽视；H7N9 亚型禽流感病毒的公共卫生意义愈发凸显，其发病水平高于既往同期，但人感染病例特点（散发性、人间传播能力、感染性、致病性）无改变。
2016 ~2017 年在养殖场的鸡群中检出了较高的 H7 亚型禽流感阳性率，主要为蛋鸡、种鸡和黄羽肉鸡，部分鸡群有明显的临床症状，如减蛋、呼吸道症状和死亡等。2017 年我国公布的部分高致病性H7N9 疫情如表 1 所示。
针对 H7N9 流感疫情的流行态势以及对家禽养殖和公共卫生的危害，农业部兽医局启动了重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株）（简称“H5+H7 二价灭活疫苗”）的生产，农业部第2541 号公告发布了该产品的试行规程、质量标准、说明书和标签等。
本研究依照产品的试行规程和质量标准，结合自身的生产工艺技术，对生产工艺进行优化，制备了 3 批不同生产工艺的（H5+H7）二价灭活疫苗 。将 3 批不同 生产 工艺 制备 的（H5+H7）二价灭活疫苗进行免疫效果对比试验，现将试验情况报告如下。
1、材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 疫苗
3 批重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗 （H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株）：试2017001 批是按照农业部第 2541 号公告发布的“H5+H7 二价灭活疫苗”产品的试行规程制备的疫苗；试 2017002 批是结合自身的生产工艺技术，对生产工艺进行优化后制备的疫苗；试2017003 批是使用优化工艺后并加入了增强剂制备的疫苗。3 批疫苗均由广东永顺生物制药股份有限公司生产。
1.1.2 试验动物
21~28 日龄 SPF 鸡，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。
1.1.3 HI 抗原
禽流感病毒 H5 亚型 Re-8 株和 H7 亚型Re1 株抗原，由国家禽流感参考实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 疫苗的安全性试验
用 21~28 日龄 SPF 鸡 40 只，随机分成 4组，每组 10 只，3 组试验组鸡分别经胸部肌肉注射不同批次的（H5+H7）二价灭活疫苗，1 次超剂量接种 1 mL/ 羽；第 4 组为空白对照组，连续观察 14 天，观察试验鸡有无发病、死亡，并在免后 14 天，每组随机抽取 5 只鸡，解剖观察。
1.2.2 疫苗的效力对比试验
用 21~28 周龄 SPF 鸡 40 只，随机分成 4组，每组 10 只，第一组（试行规程组）：经胸部肌肉接种试 2017001 批（H5+H7）二价灭活疫苗，0.3 mL/ 羽；第二组（“生物工艺”组）：经胸部肌肉接种试 2017002 批（H5+H7）二价灭活疫苗，0.3 mL/ 羽；第三组（“生物工艺”+ 增强剂组）：经胸部肌肉接种试 2017003 批（H5+H7）二价灭活疫苗，0.3 mL/ 羽；第四组（对照组）：不免疫作为正常对照组。免疫后 14、21、28 和 35 天分别翅静脉采血，分离血清，分别用国家禽流感参考实验室提供的禽流感病毒 H5 亚型 Re-8 株和 H7亚型 H7-Re1 株抗原测定 HI 抗体效价。
2、结果与分析
2.1 疫苗的安全性试验结果
3 批（H5+H7）二价灭活疫苗的安全性试验结果表明，1 次超剂量接种（1 mL/ 羽）21~28 日龄 SPF，接种后观察 14 天，3 组试验鸡均无发病，无死亡，在免疫后 14 天，每组随机抽取 5 只鸡，解剖观察，均无肉眼可见病变，疫苗的吸收情况良好，说明 3 批（H5+H7）二价灭活疫苗对SPF 鸡是安全的。
2.2 疫苗的效力对比试验结果
不同生产工艺制备的 3 批重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗，免疫 21~28 日龄 SPF鸡，免后 14 天、21 天、28 天和 35 天分别采血，分离血清，分别用禽流感病毒 H5 亚型 Re-8 株和 H7 亚型 H7-Re1 株抗原测定 HI 抗体效价。
H5N1 Re-8 的 HI 抗体几何平均滴度（GMT）检测结果如图 1 所示：在免后 14～35天，不同生产工艺制备的 3 批（H5+H7）二价灭活疫苗的 H5N1 Re-8 HI 抗体几何平均滴度（GMT）均高于规程要求的 6 log2 ，在免后 14 天HI 抗体效价逐渐升高，免疫后 14~35 天，可维持较高的 HI 抗体水平；试 2017002 批疫苗免后的 H5N1 Re-8 HI 抗体效价明显高于试2017001 批的 HI 抗体效价；试 2017003 批疫苗免后的 H5N1 Re-8 HI 抗体几何平均滴度（GMT）最高可达 11.4 log2 ，均高于试 2017002 批的 HI 抗体效价。
H7N9 Re1 的 HI 抗体几何平均滴度（GMT）检测结果如图 2 所示：在免后 14～35 天，不同生产工艺配制的 3 批（H5+H7）二价灭活疫苗的H7N9 Re1 的 HI 抗体几何平均滴度（GMT）均高于规程要求的 6 log2，在免后 14 天 HI 抗体效价开始逐渐，在免疫后 21~35 天，可维持较高的HI 抗体水平；试 2017002 批疫苗免后的 H7N9Re1 的 HI 抗体效价明显高于试 2017001 批的抗体效价，二者相差 1~2 个滴度 （log2 ）；试2017003 批疫苗免后的 H7N9 Re1 HI 抗体几何平均滴度（GMT）最高可达 10.2 log2，均高于试2017002 批的抗体效价。
试验结果表明，按照农业部第 2541 号公告发布的“H5+H7 二价灭活疫苗”的产品的试行规程制备的疫苗，免疫 SPF 鸡后，HI 抗体效价能达到规程标准要求；优化工艺后制备的（H5+H7）二价灭活疫苗，疫苗免后 HI 抗体效价有明显的提高；在优化生产工艺的基础上加入某公司增强剂，可一定程度地提高免后 HI 抗体水平，说明该增强剂对增强（H5+H7）二价灭活疫苗的效力是有效的。
3、讨论
疫苗免疫是我国目前禽流感病毒防控的主要手段之一。为进一步做好高致病性禽流感防控工作，保障养殖业生产安全和公共卫生安全，根据当前防控形势，农业部决定从 2017 年秋季开始，统一用重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株）替代重组禽流感病毒 H5 二价或三价灭活疫苗，对家禽实施强制免疫。
本研究结果表明，重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗通过种毒优化，提高免疫原性和半成品效价；选用优质原材料和独特乳化工艺：均一、稳定、高效及批间差异小；抗原纯化和精准灭活：注射应激小、副反应轻微；抗原超滤浓缩：确保疫苗中抗原含量高浓度高效价；以及增强剂的使用均可使疫苗免疫 SPF 鸡后抗体产生快、水平高及持续时间长。重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株）可预期达到同时防控 H5 亚型禽流感病毒和 H7 亚型禽流感病毒的目的。
重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株）推荐免疫程序：（1）对蛋鸡、种鸡、蛋鸭、种鸭、蛋鹅、种鹅以及生长期超过 70 天的肉鸡实行 2 次免疫，2 次免疫间隔 3~4 周。对生长期少于 70 天的肉禽进行 1 次免疫。对人工饲养的鹌鹑、鸽子、珍禽等，参考鸡的相应免疫程序进行免疫。（2）对蛋鸡、种鸡，免疫接种方法及剂量按产品说明书规定操作。胸部肌肉或颈部皮下注射，2~5 周龄鸡，每只 0.3 mL，5 周龄以上的鸡，每只 0.5 mL。（3）对鸭鹅，胸部肌肉或颈部皮下注射，2~5 周龄的鸭和鹅，每只 0.5 mL；5 周龄以上的鸭，每只1 mL；5 周龄以上的鹅，每只 1.5 mL。
今年秋季全面在家禽免疫“（H5+H7）二价灭活疫苗”，在秋冬流感高发季来到之前，使家禽产生高水平的 H5 和 H7 亚型禽流感保护抗体，对家禽业的安全生产和人的公共卫生安全都有重要作用。
参考文献
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［7］张济培，亓文宝，廖明，等．H7N9 亚型禽流感免疫程序研究初报. 中国广东畜牧兽医学会2017 论文集，2017，279-285.
作者：韩翡,李永红,王千菊（广东永顺生物制药股份有限公司，广州511356）
作者简介：韩翡（1989-），女，云南弥勒人，硕士研究生，兽医师， E-mail:vshanfei@foxmail.com
通讯作者：李永红（1968-），男，硕士研究生，高级兽医师， E-mail:lyh25f@163.com
责任编辑：曹伟胜
