同生产工艺的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对鸡的免疫效果对比试验

为评价不同生产工艺制备的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株)(简称“H5+H7 二价灭活疫苗”)对 SPF 鸡的免疫效果,将 3 批不同生产工艺制备的(H5+H7)二价灭活疫苗,分别为 2017001 批(试行规程组)、2017002批(“生物工艺”组)和 2017003 批(“生物工艺”+ 增强剂组),免疫21~28 日龄的 SPF 鸡,免疫后 14、21、28、35 天采血测定各免疫组的HI 抗体效价。在免疫后 14~35 天,3 批不同生产工艺制备的 H5+H7二价灭活疫苗组的 HI 抗体几何平均滴度(GMT)均高于规程要求的6 log 2 ,在免后 14 天 HI 抗体效价开始逐渐升高,在免疫后 14~35 天,可维持较高的 HI 抗体水平;2017002 批的 HI 抗体几何平均滴度(GMT)居中,2017003 批的 HI 抗体几何平均滴度最高。试验结果表明:不同生产工艺制备的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗均符合产品的质量标准要求;用“生物工艺”制备的疫苗免疫效果优于按规程制备疫苗,说明该“生物工艺”可生产质量稳定、高效均一的(H5+H7)二价灭活疫苗;加入某公司增强剂后,免疫效果更好,说明该增强剂可提高疫苗免后的抗体水平。

2013 年 3 月,我国首次报道人感染 H7N9 流感病毒的病例,之后H7N9 流感病毒在我国反复流行,至今已发生了第五波流行。随着时间的推移,H7N9 流感病毒从对家禽无致病性,逐渐出现对家禽高致病性的变异毒株,且污染范围不断扩大,形成高致病性和低致病性毒株同时流行的局面,给养禽业造成严重危害。H7N9 亚型禽流感病毒出现同源性、致病性和抗原性等方面的差异;活禽交易市场(主要是农贸市场)在家禽生产和贸易链中仍是 H7N9 亚型禽流感病毒污染率较高的环节,相关的运输、市场屠宰和销售等行为都有助于该病毒的传播扩散;鸡在各种动物中比较容易带毒,其他家禽对 H7N9 亚型禽流感病毒的传播也不容忽视;H7N9 亚型禽流感病毒的公共卫生意义愈发凸显,其发病水平高于既往同期,但人感染病例特点(散发性、人间传播能力、感染性、致病性)无改变。

2016 ~2017 年在养殖场的鸡群中检出了较高的 H7 亚型禽流感阳性率,主要为蛋鸡、种鸡和黄羽肉鸡,部分鸡群有明显的临床症状,如减蛋、呼吸道症状和死亡等。2017 年我国公布的部分高致病性H7N9 疫情如表 1 所示。

针对 H7N9 流感疫情的流行态势以及对家禽养殖和公共卫生的危害,农业部兽医局启动了重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株)(简称“H5+H7 二价灭活疫苗”)的生产,农业部第2541 号公告发布了该产品的试行规程、质量标准、说明书和标签等。

本研究依照产品的试行规程和质量标准,结合自身的生产工艺技术,对生产工艺进行优化,制备了 3 批不同生产工艺的(H5+H7)二价灭活疫苗 。将 3 批不同 生产 工艺 制备 的(H5+H7)二价灭活疫苗进行免疫效果对比试验,现将试验情况报告如下。

1、材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 疫苗

3 批重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗 (H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株):试2017001 批是按照农业部第 2541 号公告发布的“H5+H7 二价灭活疫苗”产品的试行规程制备的疫苗;试 2017002 批是结合自身的生产工艺技术,对生产工艺进行优化后制备的疫苗;试2017003 批是使用优化工艺后并加入了增强剂制备的疫苗。3 批疫苗均由广东永顺生物制药股份有限公司生产。

1.1.2 试验动物

21~28 日龄 SPF 鸡,由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

1.1.3 HI 抗原

禽流感病毒 H5 亚型 Re-8 株和 H7 亚型Re1 株抗原,由国家禽流感参考实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 疫苗的安全性试验

用 21~28 日龄 SPF 鸡 40 只,随机分成 4组,每组 10 只,3 组试验组鸡分别经胸部肌肉注射不同批次的(H5+H7)二价灭活疫苗,1 次超剂量接种 1 mL/ 羽;第 4 组为空白对照组,连续观察 14 天,观察试验鸡有无发病、死亡,并在免后 14 天,每组随机抽取 5 只鸡,解剖观察。

1.2.2 疫苗的效力对比试验

用 21~28 周龄 SPF 鸡 40 只,随机分成 4组,每组 10 只,第一组(试行规程组):经胸部肌肉接种试 2017001 批(H5+H7)二价灭活疫苗,0.3 mL/ 羽;第二组(“生物工艺”组):经胸部肌肉接种试 2017002 批(H5+H7)二价灭活疫苗,0.3 mL/ 羽;第三组(“生物工艺”+ 增强剂组):经胸部肌肉接种试 2017003 批(H5+H7)二价灭活疫苗,0.3 mL/ 羽;第四组(对照组):不免疫作为正常对照组。免疫后 14、21、28 和 35 天分别翅静脉采血,分离血清,分别用国家禽流感参考实验室提供的禽流感病毒 H5 亚型 Re-8 株和 H7亚型 H7-Re1 株抗原测定 HI 抗体效价。

2、结果与分析

2.1 疫苗的安全性试验结果

3 批(H5+H7)二价灭活疫苗的安全性试验结果表明,1 次超剂量接种(1 mL/ 羽)21~28 日龄 SPF,接种后观察 14 天,3 组试验鸡均无发病,无死亡,在免疫后 14 天,每组随机抽取 5 只鸡,解剖观察,均无肉眼可见病变,疫苗的吸收情况良好,说明 3 批(H5+H7)二价灭活疫苗对SPF 鸡是安全的。

2.2 疫苗的效力对比试验结果

不同生产工艺制备的 3 批重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗,免疫 21~28 日龄 SPF鸡,免后 14 天、21 天、28 天和 35 天分别采血,分离血清,分别用禽流感病毒 H5 亚型 Re-8 株和 H7 亚型 H7-Re1 株抗原测定 HI 抗体效价。

H5N1 Re-8 的 HI 抗体几何平均滴度(GMT)检测结果如图 1 所示:在免后 14~35天,不同生产工艺制备的 3 批(H5+H7)二价灭活疫苗的 H5N1 Re-8 HI 抗体几何平均滴度(GMT)均高于规程要求的 6 log2 ,在免后 14 天HI 抗体效价逐渐升高,免疫后 14~35 天,可维持较高的 HI 抗体水平;试 2017002 批疫苗免后的 H5N1 Re-8 HI 抗体效价明显高于试2017001 批的 HI 抗体效价;试 2017003 批疫苗免后的 H5N1 Re-8 HI 抗体几何平均滴度(GMT)最高可达 11.4 log2 ,均高于试 2017002 批的 HI 抗体效价。

H7N9 Re1 的 HI 抗体几何平均滴度(GMT)检测结果如图 2 所示:在免后 14~35 天,不同生产工艺配制的 3 批(H5+H7)二价灭活疫苗的H7N9 Re1 的 HI 抗体几何平均滴度(GMT)均高于规程要求的 6 log2,在免后 14 天 HI 抗体效价开始逐渐,在免疫后 21~35 天,可维持较高的HI 抗体水平;试 2017002 批疫苗免后的 H7N9Re1 的 HI 抗体效价明显高于试 2017001 批的抗体效价,二者相差 1~2 个滴度 (log2 );试2017003 批疫苗免后的 H7N9 Re1 HI 抗体几何平均滴度(GMT)最高可达 10.2 log2,均高于试2017002 批的抗体效价。

试验结果表明,按照农业部第 2541 号公告发布的“H5+H7 二价灭活疫苗”的产品的试行规程制备的疫苗,免疫 SPF 鸡后,HI 抗体效价能达到规程标准要求;优化工艺后制备的(H5+H7)二价灭活疫苗,疫苗免后 HI 抗体效价有明显的提高;在优化生产工艺的基础上加入某公司增强剂,可一定程度地提高免后 HI 抗体水平,说明该增强剂对增强(H5+H7)二价灭活疫苗的效力是有效的。

3、讨论

疫苗免疫是我国目前禽流感病毒防控的主要手段之一。为进一步做好高致病性禽流感防控工作,保障养殖业生产安全和公共卫生安全,根据当前防控形势,农业部决定从 2017 年秋季开始,统一用重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株)替代重组禽流感病毒 H5 二价或三价灭活疫苗,对家禽实施强制免疫。

本研究结果表明,重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗通过种毒优化,提高免疫原性和半成品效价;选用优质原材料和独特乳化工艺:均一、稳定、高效及批间差异小;抗原纯化和精准灭活:注射应激小、副反应轻微;抗原超滤浓缩:确保疫苗中抗原含量高浓度高效价;以及增强剂的使用均可使疫苗免疫 SPF 鸡后抗体产生快、水平高及持续时间长。重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株)可预期达到同时防控 H5 亚型禽流感病毒和 H7 亚型禽流感病毒的目的。

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8 株 +H7N9 H7-Re1 株)推荐免疫程序:(1)对蛋鸡、种鸡、蛋鸭、种鸭、蛋鹅、种鹅以及生长期超过 70 天的肉鸡实行 2 次免疫,2 次免疫间隔 3~4 周。对生长期少于 70 天的肉禽进行 1 次免疫。对人工饲养的鹌鹑、鸽子、珍禽等,参考鸡的相应免疫程序进行免疫。(2)对蛋鸡、种鸡,免疫接种方法及剂量按产品说明书规定操作。胸部肌肉或颈部皮下注射,2~5 周龄鸡,每只 0.3 mL,5 周龄以上的鸡,每只 0.5 mL。(3)对鸭鹅,胸部肌肉或颈部皮下注射,2~5 周龄的鸭和鹅,每只 0.5 mL;5 周龄以上的鸭,每只1 mL;5 周龄以上的鹅,每只 1.5 mL。

今年秋季全面在家禽免疫“(H5+H7)二价灭活疫苗”,在秋冬流感高发季来到之前,使家禽产生高水平的 H5 和 H7 亚型禽流感保护抗体,对家禽业的安全生产和人的公共卫生安全都有重要作用。

参考文献

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[7]张济培,亓文宝,廖明,等.H7N9 亚型禽流感免疫程序研究初报. 中国广东畜牧兽医学会2017 论文集,2017,279-285.

作者:韩翡,李永红,王千菊(广东永顺生物制药股份有限公司,广州511356)

作者简介:韩翡(1989-),女,云南弥勒人,硕士研究生,兽医师, E-mail:vshanfei@foxmail.com

通讯作者:李永红(1968-),男,硕士研究生,高级兽医师, E-mail:lyh25f@163.com

责任编辑:曹伟胜

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